从遗传病角度谈转化检验医学

科技日报：今年1月30日，美国总统奥巴马在白宫正式宣布美国启动“精准医学”研究计划，什么是精准医学？美国启动的精准医学研究计划的主要内容是什么？

关于精准医学的最新进展

曹雪涛：精准医学是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式，本质上是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确亚分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益。第一页，共57页。诊断:关键是需要获得Biomarker

早期诊断，以便早期干预，往往只能采集血样个性化治疗，已经诊断出疾病，往往可以采集到病变组织样本，多用于肿瘤的个性化治疗第二页，共57页。临床上能提供的样品外周血样本；脑脊液等其他体液粪便、尿液等排泄物新鲜组织样本；石蜡包埋组织样本；第三页，共57页。围绕外周血样本的医学研究血浆游离的DNA游离的RNA蛋白细胞内DNA细胞内RNA细胞内蛋白有粒白细胞无粒白细胞中性粒白细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞淋巴细胞单核细胞（巨噬细胞）白细胞第四页，共57页。血浆中生物分子的用途血浆游离的DNA：无创产前筛查、肿瘤早期诊断、肿瘤治疗疗效评估游离的RNA蛋白：无创产前筛查、肿瘤早期诊断、肿瘤治疗疗效评估第五页，共57页。血浆中游离DNA的用途之一：无创产前筛查方法学：第二代测序，和高密度SNP芯片技术。要检出21、13、18三条染色体的三体第六页，共57页。游离的肿瘤细胞DNA大肠

血管Septin9基因的甲基化在肿瘤中特异发生

高度甲基化的Septin9基因是结直肠癌癌变过程中，特异性早期诊断的标志物之一，在结直肠癌发病早期，已高度甲基化的Septin9基因被癌细胞释放到外周血中参与血液循环，通过检测外周血中Septin9基因的甲基化程度，可初步判断受检者患有结直肠癌的风险。肿瘤细胞正常细胞注册号：国械注进20143405186；生产厂商名称：EpiGenomicsAG（德国）产品名称；Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）：由于只需要检测一个基因的甲基化我国批准的第一个从DNA甲基化来早期诊断肿瘤的诊断产品第七页，共57页。结直肠癌的癌变与Septin9基因甲基化正常细胞发生癌变基因甲基化发生在癌变早期肿瘤细胞胞嘧啶发生甲基化表达量降低/失活肿瘤细胞中DNA发生高度甲基化甲基化正常细胞未甲基化第八页，共57页。血浆中游离DNA的用途之三：肿瘤治疗疗效的监测ScienceTranslationMedicine,19February2014,vol6ctDNA：circulatingtumorDNA第九页，共57页。ctDNA监测肿瘤的治疗效果ctDNA的含量肿瘤组织体积左图，经过化疗后肺癌组织的体积没有明显变化，但是ctDNA消失，结果22个月后，病人没有出现复发；右图，经过化疗后肺癌组织的体积明显缩小，但ctDNA含量上升，结果在12个月后发现肿瘤转移，13个月病人死亡Newman,A.Metal.,NatureMedicine,2014,20(5):548-556,第十页，共57页。研究外周血中游离DNA的关键因素要找到病变组织特征的biomarker，例如DNA甲基化、DNA点突变（非先天性的体细胞突变）。例如乳腺癌病人癌组织中若存在BRAF基因突变，则可以通过血浆检测到。方法学：第二代测序，和数字PCR技术第十一页，共57页。肿瘤患者抽取5ml外周血，提取其中的ctDNA能检出含量低至0.01％的突变DNA上万倍稀释，每个油包水颗粒中最多含有1个DNA拷贝VIC荧光通道dPCR荧光检测FAM荧光通道突变型DNA野生型DNA阴性液滴数字PCR的技术原理第十二页，共57页。围绕外周血样本的医学研究血浆游离的DNA游离的RNA蛋白细胞内DNA细胞内RNA细胞内蛋白有粒白细胞无粒白细胞中性粒白细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞淋巴细胞单核细胞（巨噬细胞）白细胞第十三页，共57页。血细胞DNA指征遗传性细胞内DNA细胞内RNA细胞内蛋白有粒白细胞无粒白细胞中性粒白细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞淋巴细胞单核细胞（巨噬细胞）外周血白细胞致病性突变易感性基因第十四页，共57页。基因的致病性突变单基因遗传病：地中海贫血、血友病、DMD。新生儿呼吸窘迫综合征中的ABCA3、SFTPB、SFTPC、FOXF1、NKX2.1、CSFR2A、CSFR2B基因突变都可以致病弱精患者中，GALNTL5基因突变基本特征都是：基因突变改变了编码蛋白质的功能致病性突变、多态性、临床意义尚不明确的突变（核酸碱基改变，也会改变氨基酸序列，但是否会改变蛋白质功能尚不明确）第十五页，共57页。基因芯片在地贫基因突变检测上的应用基因芯片膜基质的基因芯片玻璃基质的基因芯片基于流动微珠的基因芯片-液相芯片第十六页，共57页。地贫基因突变检测液相芯片技术1、目前市面上已经有若干地贫基因突变检测试剂盒，为什么还要研发基于液相芯片的试剂盒；2、为什么地贫在我国广东、广西、海南等热带沿海一代，直至地中海沿海一代高发？3、随着地贫基因检测的不断推广，重型地贫患儿的出生越来越少，地贫基因检测逐步变得不重要了？第十七页，共57页。目前β地贫点突变主要的诊断方法-

斑点反相膜杂交技术第十八页，共57页。目前α地贫缺失的诊断方法-Gap－PCR第十九页，共57页。反相斑点膜杂交方法的缺陷1、样本通量不够，自动化程度低；2、结果的判读需要实验者积累了较长的经验；3、点突变和缺失突变检测分成不同的试剂盒检测；尤其在新筛项目中加大工作量第二十页，共57页。国内2004年就有单位认为液相芯片开发地贫基因诊断具有很好的前景第二十一页，共57页。基于反相斑点杂交的地贫诊断原理示意图被检基因片段玻璃片或者硝酸纤维素膜探针22第二十二页，共57页。123可多达100种微球被检基因片段液相芯片杂交原理示意图

自动化程度高、检测样本量大、结果准确第二十三页，共57页。达安Luminex－100种编码，不同的红外材料混合24反相斑点杂交，行与列位置编码红外材料远红外材料第二十四页，共57页。基因组DNAPCRA体系，扩增点突变PCRB体系，扩增缺失突变Tag序列生物素1号珠子耦联1种探针第n号珠子耦联不同的探针A体系和B体系的PCR产物混合在8联排管或者96孔板中用MAGPIX实现自动化检测MAGPIX液态悬浮芯片技术检测地贫基因突变的技术路线，全部过程在6小时内完成第二十五页，共57页。广东省妇幼保健院研发了地贫液相芯片，在广东省做了分子流调，14,332个家庭，共计40808个样本。第二十六页，共57页。广东省户籍人群地贫基因平均携带率为16.8％，其中13.31%的α地贫突变，4.53%的β地贫突变地贫液相芯片技术的应用——全省地贫基因携带分子流调第二十七页，共57页。以上分子流调是基于自有专利液相芯片试剂盒技术第二十八页，共57页。AmJHematol.2014Aug13.doi:10.1002省妇幼发表的Luminex液相芯片方法学文章第二十九页，共57页。液相芯片的优点包括

1、由于完全在液态的环境中完成芯片反应，结果重复性好，准确度高；2、自动化程度高，一套系统每天可完成500人份样本的检测，检测能力是目前方法的8倍以上；3、检测突变位点多，共计中国人群常见的23个突变位点，包括β-地贫的17个点突变，α地贫的3个点突变，以及α地贫的3个缺失突变可一次检完；4、结果通过数据化处理自动给出，无需人工肉眼凭借经验来评判；第三十页，共57页。Luminex还开发了呼吸道病原体液相芯片第三十一页，共57页。血细胞DNA指征遗传性细胞内DNA细胞内RNA细胞内蛋白有粒白细胞无粒白细胞中性粒白细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞淋巴细胞单核细胞（巨噬细胞）外周血白细胞致病性突变易感性基因第三十二页，共57页。但迄今为止，通过GWAS方法找到了两个与子痫前期相关的易感基因，STOX1和ACVAR2A。即使统计学意义上显著，风险系数OR值不超过1.5倍，没有实际的临床应用价值很多疾病具有一定的遗传性，例如妊娠期疾病，我们期盼女性在怀孕前通过分析血样的DNA，就能预测其怀孕时发病的可能性，以做到提前干预基因的易感性SNP位点第三十三页，共57页。第三十四页，共57页。如何评估易感性基因是否可做临床应用安徽医科大学张学军团队，银屑病易感性基因GWAS研究NatureGenetics,2009,VOL41PSORS1基因的rs1265181位点，p=1.93×10^-208,OR＝22.62所用的临床样本数目和种族统计学p值风险系数OR值第三十五页，共57页。多囊卵巢综合征、早产、唇腭裂迄今都没有发现可临床应用的易感基因；即使是明确的易感性基因，例如BRCA1/A2基因基因的易感性突变Plon,S.E.,etal.HumanMutation,2008第三十六页，共57页。a1

b5b4b2b3b6b1c1+/--/-+/-+/-+/--/--/--/--/-+/-:Male:Female:Breastcancera2目前42岁，尚未发现乳腺癌43岁诊断出乳腺癌，37岁诊断出乳腺癌，35岁诊断出乳腺癌，c2+/-现32岁现38岁现6岁现4岁c3现14岁

＋表示BRCA2基因的一个突变位点一个家族性乳腺癌第三十七页，共57页。外周血有核细胞基因表达RNA的科研价值细胞内DNA细胞内RNA细胞内蛋白有粒白细胞无粒白细胞中性粒白细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞淋巴细胞单核细胞（巨噬细胞）外周血白细胞基因芯片技术，以及第二代测序技术可以同时检测外周血有核细胞3万多个基因的表达信息第三十八页，共57页。机体环境的改变，例如肿瘤细胞出现分泌出特有的化学因子，刺激外周血中有核细胞的基因表达改变细胞核表达出mRNA第三十九页，共57页。从外周血中筛选肺结核菌感染活性状态的基因表达标签Nature,19August2010大多数人感染结核后无症状，处于潜伏期。只有10％的人会发展成活性状态的肺结核。目前没有方法能检测哪些人可能会发展成活性的结核。第四十页，共57页。实验样品来源第一批testset病人：59名参与者，在分析过程中有19名被排除，包括1名病人年龄超过实验设计，5名活性TB病人的培养物中没有发现TB，7名潜伏TB病人IGRA检测阴性，2名健康对照TST检测阳性，1名对照IGRA结果不能确认。在实验中，一名参与者的RNA提取后不够，也排除分析之外，最终有42名参与者，包括12名正常对照；17名TB潜伏者；13名活性TB病人。第一批validationset病人：75名英国London地区参与者，在分析过程中有21名被排除，包括8名活性TB病人培养阴性，1名活性TB病人的血样不够，1名活性TB病人HIV阳性，7名潜伏期人IGRA检测阴性，1名健康对照TST阳性，3名健康对照IGRA阳性。最终54样本参与分析，包括12名对照，12名潜伏的TB病人，以及21名活性TB病人。第二批validationset病人，来自南非CapeTown地区85名参与者，也有32名不符号各种标准，最后有51名人参与，分为潜伏期TB31名，活性期TB病人30名，没有设置健康对照。第四十一页，共57页。筛选得到的基因能反应治疗的疗效

这393个基因的表达改变会随着活性病人的治疗而消失，说明通过监测外周血的表达变化能监测治疗的疗效。ThusthebloodtranscriptionalsignatureofpatientswithactiveTBcouldbeusedtomonitorefficacyoftreatment,andisreflectiveofthehostresponsetoinfectionwithM.tuberculosis第四十二页，共57页。筛选针对TB感染所特异的基因先期找到的这393个基因可能反应的是很多疾病中都出现的共同的炎症反应，因此作者又筛选出86个基因，通过和其他细菌感染性疾病和炎症疾病比较，是TB病人所特异的。第四十三页，共57页。筛选出来的TB-specific的86个基因仍然能很好反应出疾病的差异第四十四页，共57页。这86个基因也能吻合地反应治疗的效果第四十五页，共57页。文章结论ThissignatureofactiveTB,activedin10-20%ofpatientswithlatentTB,mayidentifythoseindividualswhowilldevelopactivedisease,facilitatingtargetedpreventativetherapy,butlongitudinalstudiesareneedtoassessthis.第四十六页，共57页。47不明病原体高通量筛查基因芯片技术的历史发展：

国际上已经在不明病原体引发的突发疾病方面开发快速检测芯片技术进行了尝试，但还局限在美国，例如美国加州大学旧金山分校DeRisi实验室研发的能检测1500多种病毒的Virochip芯片[1]，美国哥伦比亚大学Lipkin实验室和美国军方合作研发的能同时检测1710种病毒、135种属细菌、73种属真菌，以及63种属的寄生虫的GreeneChip芯片[2]，和美国劳伦斯—利弗莫尔全球安全国家实验室研发的MDA芯片[3]，也可以同时检测所有已经测序过的细菌和病毒都已经在实际临床应用中解决了大量不明病原体检测的问题[4][1]Chiu,C.Y.,etal.,JClinMicrobiol,2007.45(7):2340-3.[2]Palacios,G.,etal.,EmergInfectDis,2007.13(1):73-81.[3]Gardner,S.N.,BMCGenomics,2010,11:668[4]McLoughlin,K,S,BriefingsinFunctionalGenomics,2011,10:342-353第四十七页，共57页。48国内研发的高通量病原体筛查芯片广东省妇幼保健院参与文章署名第四十八页，共57页。491、芯片上共计6万条探针，可检测2,554种以脊椎动物为宿主的病毒；124个属的细菌、38个属的真菌、47个属的寄生虫。并且每种病原体检测指标都设计了多条探针，充分利用了生物芯片的高通量；2、能检测到在目前已知病原体基础上发生变异产生的新病原体；主要得力于芯片上探针的设计是具有一定兼容性的寡聚核苷酸长探针，并且针对病毒的科、属、种不同层次上都设计了探针；3、检测周期短，判读结果直观。从获得样本到给出结果可控制在48小时以内。基于每种病原体有多条探针，以及临床没有症状的样本作为阴性背景，判读结果不仅仅基于芯片探针的杂交信号强弱，更基于探针信号富集度的判断。第四十九页，共57页。生物芯片一次检测所有病原体，并按照统计学意义进行排序。结合临床症状就容易判断出主要的病原体。传统方法如PCR、培养等，需要单个单个检测，要靠运气才能筛到引起临床症状的病原体第五十页，共57页。河北保定一家医院接诊了数位临床症状类似的病人，病人高烧、伴有咳嗽，咽部充血、出现了肺部组织坏死、支气管肺炎等症状；但用qPCR检测支原体、流感病毒等为阴性。取病人的血清，提取血清中的核酸后用芯片进行了测试。文章中列举临床案例之一第五十一页，共57页。芯片杂交图例子52采用美国Agilent芯片的原位合成的方法合成芯片。一张芯片上含有6万条探针。并且可以随着病原体数据库的更新而重新加入新的探针。第五十二页，共57页。发现人体腺病毒(humanadenovirus)相关的探针明显出现杂交信号

探针正常人患者患者/正常从种（species）上判读从属（genus）上判读vm.264113822224161.0unidentified_adenovirusMastadenovirusvm.27371441399097.1unidentified_adenovirusMastadenovirusvs1.74931441355594.5Human_adenovirus_type_34Mastadenovirusvs2.6231261100687.7Human_adenovirusMastadenovirusvm.26111411017072.1unidentified_adenovirusMastadenovirusvm.27344112817968.6unidentified_adenovirusMastadenovirusvm.2604137899065.6unidentified_adenovirusMastadenovirusvs2.566120713459.7Human_adenovirusMastadenovirusvs1.74923261620149.7Human_adenovirus_type_34Mastadenovirusbacts.28885061983739.2MicrococcusMicrococcusvs1.5862219858639.2Human_adenovirus_type_7Mastadenovirusvt.7109136530339.0untyped_Human_adenovirusMastadenovirusvs1.6601130505838.9Human_adenovirus_type_35Mastadenovirusvs2.6212751058938.5Human_adenovirusMastadenovirusvm.2599152570037.5unidentified_adenovirusMastadenovirusbacts.288910133786037.4MicrococcusMicrococcusvs1.6599114403735.4Human_adenovirus_type_35Mastadenovirusvm.2657228746032.7unidentified_adenovirusMastadenovirusvm.2733129396130.7unidentifie