第十三章体外受精与核移植动物

为什么要进行动物人工繁殖？1）野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非常低，78%的雌性大熊猫不孕，圈养大熊猫90%的雄性大熊猫不育。2）野生中华鲟产卵场分布在金沙江下游和长江上游的约600公里江段。葛洲坝、三峡大坝阻断了洄游路线，为了补偿对中华鲟造成的不利影响，我国在宜昌成立了中华鲟研究所,人工繁殖的幼鲟，投放长江。3）对于人类，世界范围内不孕夫妇占10％左右，需要建立人工助孕技术。第一页，共90页。所有的这一切，都必须依赖于动物细胞工程，尤其是胚胎工程和核移植技术。第二页，共90页。精、卵人工授精体外受精体内发育早期胚胎胚胎移植受体动物在受体子宫发育出生胚胎冷冻胚胎分割、融合体/胚胎细胞卵母细胞核移植体外培养体外培养精、卵有性生殖无性生殖动物细胞工程第三页，共90页。胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子进行的工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割与融合、胚胎/精子/卵子冷冻保存、胚胎性别控制、胚胎细胞核移植、基因导入等。

第一节胚胎工程第四页，共90页。胚前期：受精—第2周末受精、卵裂、形成胚泡。胚期：第3周—第8周末三胚层的形成和分化，各主要器官原基的建立胎期：第9周—出生第五页，共90页。体外受精动物(试管动物)：将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。体外受精：哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。

第二节体外受精动物第六页，共90页。

发挥优良母畜的繁殖潜力

一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，而最终只有一个卵泡成熟并排卵，如果受精也只能生出一只良种牛犊。一只良种母畜一生只可能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。如果能让更多的卵泡成熟排卵，而又让品质平凡的同种母畜“借腹怀胎”，优良母畜可以获得后代的数目至少增加几十倍。意义第七页，共90页。促进家畜改良的速度由于提高了繁殖能力，可以使一头母畜在一个性周期内繁殖更多的仔畜，从而在短期内使优良种畜得到大量繁殖，促进了家畜改良的速度。保存遗传资源

对优良母畜或稀有哺乳动物有计划地保存胚胎，建立起“胚胎库”。异地移植只需运输冷冻胚胎即可，而且可以有计划地进行胚胎采集和移植，优良胚胎的利用率就会大大提高。第八页，共90页。①精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养；②体外受精；③重组胚激活与体外培养；④胚胎移植；⑤体内发育、出生。体外受精动物培育的步骤第九页，共90页。采集精子并选择有活力的精子精子的体外获能：是指精子获得穿卵子透明带能力的过程。采用添加诱导精子获能物质(钙离子、血清蛋白、肝素等)的特定培养液来完成精子体外获能。

1、精子的采集与体外获能第十页，共90页。精子的结构头部：顶体、细胞核尾部：颈、中段、主段和末端。顶体内部含有水解酶，能协助精子穿入卵周围的卵膜。精子质膜外表面存在有多种凝集素受体。鞭毛为9＋2微管结构精子在睾丸生精小管内产生，是单倍体。第十一页，共90页。(一)成熟卵细胞的收集

超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，利用手术取出卵母细胞。目的是最大限度地利用母畜的生殖能力（牛超数排出5-10个卵母细胞）卵细胞的收集：在腹腔镜下用吸管吸出卵细胞。

2、卵细胞的回收与成熟培养第十二页，共90页。卵子的结构卵细胞内部物种空间分布具有极性，卵内组分沿着卵的主轴分布不均匀，形成动物级和植物级。卵黄积聚在植物级卵细胞质分布在两个固定的区域，质膜下细胞质称为皮层，皮层是高度粘滞、半硬的凝胶状，内含有皮层颗粒和色素颗粒。大部分卵细胞质——内质是液体状态，内含线粒体和生殖质。卵细胞排出卵巢后，有卵膜包被

第十三页，共90页。卵子的发生在哺乳类，所有卵原细胞成熟和卵原细胞转变为卵母细胞是在胎儿分娩前完成。卵母细胞形成阶段是从胎儿诞生开始一直到性成熟排卵为止。直到青春期卵母细胞才进行生长，以后每个性周期后有一批新的卵母细胞继续发育，而多数卵母细胞在每个周期发育中未成熟就退化。第十四页，共90页。卵细胞从卵巢排出的卵子，处于减数第二次分裂的中期，卵子进入输卵管，待受精后才完成第二次成熟分裂。

第十五页，共90页。(二)卵母细胞的收集、选择与成熟培养

活体卵巢采集；屠宰后家畜的卵巢中采集。卵母细胞的选择:分A（三层以上卵丘细胞，卵母细胞质均匀）B（卵丘细胞低于三层，卵母细胞质均匀)、C（裸露卵母细胞）和D（死亡或退化卵母细胞）四个等级，一般选择A级和B级卵母细胞。

第十六页，共90页。卵母细胞的体外成熟培养成熟的标志：生发泡破裂；染色体凝集；极体排出；透明带软化；卵丘细胞扩展。第十七页，共90页。精卵放在一起培养①共培养体外受精：②显微受精技术：透明带下注射法、卵浆内精子注射法、透明带修饰法。受精卵是否可以发育至囊胚是受精是否成功的标志。

3、体外受精第十八页，共90页。精子和卵子经过受精作用形成受精卵，受精卵经过卵裂、形成囊胚，囊胚进一步发育进入原肠胚阶段，形成不同胚层，再产生器官原基，进一步产生个体。第十九页，共90页。体外受精第二十页，共90页。受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期才能进行移植。移植的较佳时期是发育至8-16细胞期的胚胎。

4、胚胎培养第二十一页，共90页。卵裂：合子发生分裂形成若干小细胞。卵裂细胞不生长而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变化的过程。桑椹胚：卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名。受精卵在进行卵裂的同时，逐渐向子宫腔移动。受精后72小时，桑椹胚进入子宫腔。第二十二页，共90页。卵巢第二十三页，共90页。胚泡：哺乳动物的胚胎处于16细胞期的桑椹期时，胚胎是球型细胞团，细胞之间形成充满液体的腔隙，然后它们联合形成一个大腔位于胚胎的一端，即为胚泡结构。囊胚：桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔的细胞组成囊胚层。原肠胚：囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。胚泡腔内细胞群第二十四页，共90页。哺乳动物胚泡着床内细胞团：在胚泡胚极一端，能够发育成为胚胎主体的一团细胞。滋养层细胞：外层发育成为胎盘的细胞。着床：或叫植入，胚泡和子宫壁相互接触并侵入子宫组织的过程。时间：在受精后5～6天开始，至11～12天完成

部位：通常在子宫底部或体部

第二十五页，共90页。胚泡桑椹胚4细胞2细胞卵裂受精排卵排卵、受精与卵裂过程第二十六页，共90页。

5－8周人胚外形演变第二十七页，共90页。第二十八页，共90页。概念：是指将发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术。供体：提供胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。

“借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”胚胎的来源：◆体外受精、培养的胚胎◆经超排、输精（体内人工受精）后，回收的早期胚胎移植的方法：有手术法（小型家畜）和非手术法（大型家畜）

5、胚胎移植第二十九页，共90页。我国从20世纪70年代开始胚胎移植的研究，先后在山羊（1974年）、牛（1978年）、家兔（1979年）上获得成功。

中国首例胚胎移植的藏獒第三十页，共90页。胚胎分割：借助显微操作技术或徒手操作方法，切割早期胚胎成2、4等多等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎利用率的一种有效途径。胚胎分割技术不仅可以使胚胎移植的胚胎数目成倍增加，而且可以产生遗传性状相同的后代，因此是一种广义上的克隆技术。胚胎分割与胚胎融合第三十一页，共90页。第三十二页，共90页。胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。将同一种类的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以获得多个黑白相间的花鼠。将不同种的绵羊和山羊的胚胎融合，可得到拥有绵羊和山羊双重特性的新品种——“绵山羊”。大鼠-小鼠、绵羊-山羊、马-斑马、黄牛-水牛等属间嵌合体动物。第三十三页，共90页。异种嵌合体：山羊－绵羊第三十四页，共90页。囊胚注射法：把某些种类细胞（卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至是已经分化的细胞）注射入囊胚的囊胚腔中。胚胎融合的方法聚合法：两个不同的桑椹胚去透明带后聚合。第三十五页，共90页。为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段可以形成具有高度杂种优势的杂合体不仅可成倍缩短家畜改良时间，而且也为创造新型的家畜品种提供新的技术手段（如生产具特殊皮毛特性的新品种）胚胎融合的意义第三十六页，共90页。1978年世界首例试管婴儿在英国成功。1983年，澳大利亚创造了世界第一个冷冻试管婴儿。1984年，澳大利亚诞生了一胚4胎的试管婴儿，创造了世界多胚胎试管婴儿的记录。第三节试管婴儿世界上第1例试管婴儿LouisBrown

在英国诞生第三十七页，共90页。试管婴儿：体外受精结合胚胎移植技术（IVF-EF），分别将卵子和精子取出后体外受精，发育成胚胎后再植回母体子宫内发育、出生获得婴儿的技术。第三十八页，共90页。

现在全世界范围内已出生数以万计，妊娠成功率都有迅速的提高,妊娠率提高到20-30%。我国在这方面的工作相对起步较晚，1985年我国台湾省出生第1例试管婴儿，1986年香港也出生1例。大陆首例试管婴儿于1988年3月10日在北大三院诞生。她的母亲是一位38岁、原发不孕20年、双侧输卵管不通的患者。第三十九页，共90页。中国双胞胎试管婴儿第四十页，共90页。三个阶段的试管婴儿第一代试管婴儿1977年Steptoe和Edwards创造的常规试管婴儿为第一代试管婴儿。第四十一页，共90页。第一代“试管婴儿”正确的称呼应该是体外受精和胚胎移植，将卵子和精子先分别在玻璃器皿中培育两天，然后让卵子受精，待受精卵分裂成有4-8个细胞的早期胚胎，再移植入人的子宫内继续生长发育直至分娩。目前全球已诞生了数十万“试管婴儿”。第一例“试管婴儿”是1978年英国专家定制了世界上第一个试管婴儿名叫露易丝-布朗，已婚。第一代“试管婴儿”主要适合于输卵管堵塞，子宫内膜异位症等引起的不孕症患者。全部过程手术费及药费约15000元。第四十二页，共90页。第二代试管婴儿

1992年Palermo的单精子注射卵细胞浆内（ICSI）是第二代试管婴儿。通过先进的显微注射仪将单个精子注射进卵细胞内使其受精，因此这种方法又称为显微受精。第二代试管婴儿的技术关键在于显微操作系统与注射技术的建立等。第四十三页，共90页。第二代“试管婴儿”正确的称呼是胞质内单精子注射。这是一种精确而细巧的技术，需要在显微镜下操作。国内医学界将ICSI称为第二代试管婴儿技术。ICSI不仅提高了成功率，而且使试管婴儿技术适应症大为扩大，全部过程手术费及药费约18000元--20000元。此项技术的成功率45%--50%。第四十四页，共90页。第三代试管婴儿

通过种植前遗传学诊断（PGD）技术培育出的试管婴儿将被称为第三代试管婴儿。从体外受精的胚胎取出部分细胞进行基因诊断，排除带致病基因的胚胎后再进行移植，从而实现胚胎着床前即诊断出遗传病症的愿望。1990年，世界首例PGD试管婴儿成功培育。第四十五页，共90页。第三代“试管婴儿”实际上侧重于胚胎着床前的遗传诊断。与第一、二代“试管婴儿”一样，要经过体外受精获得胚胎。当胚胎发育到4-8个细胞的胚胎时，镜下取出1或2个细胞（医学上通常称为分裂球）进行遗传学检查，并保持其完整性。如果明确胚胎没有遗传病，再将它移植到人的子宫内，使之继续生长发育。在1989年已取得成功。人群中有1/5-1/4患有遗传性疾病，平均每人携带5-6个隐性基因，若能够在胚胎移植前就明确有无遗传性疾病，将大大提高出生后婴儿的质量。第四十六页，共90页。◆借助别人卵浆增强自己卵子活力◆特征：卵浆置换◆主要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性。第四代试管婴儿第四十七页，共90页。第四代“试管婴儿”是卵浆置换技术的简称。2003年6月5日，武汉大学人民医院生殖医学中心为40岁的李女士成功进行卵浆置换手术，标志第四代“试管婴儿”首次在我国成功运用。手术中医生通过显微镜将李女士卵子内的卵浆与另一健康女性的卵浆置换，增强其卵子活力，与其丈夫的精子体外结合，受精卵再移入体内。第四十八页，共90页。世界试管婴儿诞生记录

１９７８．７．２５英国女世界第一个试管婴儿

１９７８．１０．３印度女印度第一个

１９７９．１．１４英国男第一个男性婴儿

１９７９．６．２３澳洲女澳洲第一个

１９８０．６．６澳洲一男一女首例试管婴儿双胞胎

１９８１．１０．１９英国女第一个黑白混血儿试管婴儿

１９８１．１２．２８美国女美国第一个

１９８２．９．２２以色列女以色列第一个

１９８２．９．２７瑞典女瑞典第一个

１９８３．５．２０新加坡男东南亚第一个试管婴儿

１９８３．６．８澳洲二女一男首例三胞胎

１９８４．１．１６澳洲四男首例四胞胎第四十九页，共90页。１９８５．４．１６中国台湾男台湾首例试管婴儿

１９８８．３．１０中国大陆女中国大陆首例试管婴儿

北医大三院

１９８９．８．２６中国大陆男中国大陆首例三胞胎

北医大三院１９９２．６．１２中国大陆男中国大陆首例赠卵试管婴儿

北医大三院

１９９５．２．６中国大陆女中国大陆首例冻融胚胎试管婴儿

北医大三院第五十页，共90页。女方超排卵与取卵精子采集与体外获能处理体外受精受精卵体外培养胚胎移植胚胎移植（选择8细胞胚胎）与观察子宫内发育、婴儿诞生

试管婴儿（第一代）技术步骤第五十一页，共90页。

第四节核移植动物第五十二页，共90页。细胞核移植:是利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。细胞核移植动物又称克隆动物:用特定发育阶段的核受体体外构建重组胚，通过胚胎移植到受体完成发育出生的动物。包括胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物。

第五十三页，共90页。发展历程1952年，美国人罗伯特.布里格斯对豹蛙发育到囊胚期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个可以摄食的豹蛙幼体。

1958年到1962年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。使用最多的克隆方法——胚胎细胞克隆第五十四页，共90页。1996-1997年首只体细胞克隆动物“多莉”羊的成功证明了成熟的体细胞核也具有全能性。里程碑式的突破第五十五页，共90页。CreatingDolly！1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界。第五十六页，共90页。多莉的生命历程1998年4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动物也能生育。2003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊”。第五十七页，共90页。1、核供体细胞的选择（胚胎细胞/胚胎干细胞/成体细胞）与细胞核的获得。2、核受体细胞的选择（成熟的卵母细胞）与细胞核的去除（显微去核/射线去核/化学法去核）。3、细胞核移植：将供体核移植入已去核的受体细胞内常用方法直接(胞质内)注射和透明带下注射两种方法4、重组胚泡的激活(电激活和化学激活)。

1、细胞核移植动物培育流程第五十八页，共90页。5、重组胚的培养和移植

激活的重组胚桑椹胚/囊胚胚胎移植6、体细胞核移植后代的鉴定体外培养体内培养第五十九页，共90页。使用最多的克隆方法胚胎细胞分化程度低，容易成功。

2、胚胎细胞核移植克隆动物第六十页，共90页。核移植小鼠（1981年1月Science杂志）第六十一页，共90页。真正意义的克隆

——体细胞克隆

3、体细胞克隆动物第六十二页，共90页。第六十三页，共90页。应用与意义

1、检验动物细胞全能性

2、加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物

3、利用转基因克隆动物进行生物药物的生产

4、异种器官移植（结合特异基因的敲除）

5、治疗性克隆（可以用患者本人细胞培育出新组织）

第六十四页，共90页。有关克隆动物与人存在的问题？第六十五页，共90页。1、技术尚不成熟得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出277个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。第六十六页，共90页。2、遗传、疾病问题

克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。

第六十七页，共90页。3、社会、伦理学问题第六十八页，共90页。社会关系父子？兄弟？母亲？归属感？第六十九页，共90页。问题1：克隆人是不是正常的人？怎样看待克隆人？第七十页，共90页。谁生他?谁养他?谁爱他?谁嫁他?克隆人如何生存？前提：与技术问题脱钩，只面对情感与伦理。克隆人生出来就是一个与常人无异的人。第七十一页，共90页。问题2：英雄、伟人可以再生吗？

第七十二页，共90页。性格与情感上：是否完全一样？克隆人同正常人一样有情感和感受，但克隆人的情感和被克隆人并不一样。虽然一个人的性格一部分由基因决定，是天生的，但外部环境对形成一个人的性格起更大作用。第七十三页，共90页。问题3：身体上任何一部分的细胞是否都可以用来克隆？

第七十四页，共90页。问题4：人可以无休止地被克隆吗？

第七十五页，共90页。问题5：是否是人类的倒退？第七十六页，共90页。许多国家出台法律禁止生殖性克隆。�有性生殖是历史进化的结果，利于种族繁衍和生存，以及优良性状的形成。选择无性生殖——克隆的方式不利于遗传多样性的保护。从有性繁殖到无性繁殖,就进化而言是一种退化。第七十七页，共90页。保证人工受精、胚胎移植不受环境、地点和时间的限制为建立优良动物胚胎库提供可能第五节冷冻保存技术第七十八页，共90页。非冷冻保存

胚胎冷藏保存法：一般在0－4℃左右保存冷冻法

是指－196℃保存胚胎，此技术为建立优良品种的胚胎库或基因库提供了条件，同时也便于胚胎的运输与移植。

抗冻保护剂的选择冷冻方法的选择

胚胎冷冻保存第七十九页，共90页。抗冻保护剂的选择①渗透型冷冻保护剂：属于细胞内冷冻保护剂。常见的有甘油、二甲基亚砜、丙二醇和乙二醇。②非渗透型冷冻保护剂：属于细胞外冷冻保护剂，一般为高分子物质。常见的有单糖（葡萄糖）、二糖（蔗糖）、三糖。第八十页，共90页。冷冻方法的选择程序冷冻与复苏胚胎①将采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗涤2次。②将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol/L甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡20min。③将胚胎和冷冻液装入0.25mL胚胎冷冻细管中，封口，并在细管外标记供体号、胚胎数量、等级、冷冻日期等。第八十一页，共90页。④将装入胚胎的细管放入冷冻仪中，在0℃平衡10min，以1℃/min的速度降至-7至-6℃，平衡10min，然后以0.3℃的速度降温至-38至-35℃，投入液氮保存。⑤解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管，在空气中平衡10s，立即置于37℃水浴解冻，1min后取出完成解冻过程。⑥将细管中的冷冻液及胚胎推出，