实验二血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及

实验二血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及第1页/共17页实验二血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及定量测定

第2页/共17页一、目的要求1、掌握722型分光光度计的使用。2、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定。3、掌握血红蛋白标准曲线的绘制。

第3页/共17页二、实验原理

血红蛋白（Hb）与O2结合生成氧合血红蛋白（HbO2），与CO结合生成一氧化碳血红蛋白（HbCO），因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础，如HbO2在可见光波长400~600nm范围内有三个特征的吸收峰，其峰值分别在415、541和576nm处，当氧合血红蛋白转为一氧化碳血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，在波长419、540和569nm处出现三个特征的吸收峰，其中在500~600nm范围内三个特征的吸收峰如下图。

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本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其光吸收度，以吸光度（A）（又称光密度）为纵坐标，波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。第5页/共17页三、仪器和试剂

1．仪器：试管及试管架；吸量管；滴管和量筒；722型分光光度计；CO发生器。

2．试剂：

（1）浓H2SO4；（2）甲酸；（3）蒸馏水；

（4）血红蛋白溶液。

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722型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定量的分析。该仪器广泛应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，是生物化学实验室常用分析仪器之一1、722型分光光度计的使用第7页/共17页基本原理

溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律

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朗伯比尔定律：A=εlcε：摩尔吸光系数

c：溶液的浓度

l：液层的厚度

A：物质的吸光度

第9页/共17页操作方法

预热仪器

选定波长

调节T=100％

固定灵敏度档

调节“0”点

测定

关机第10页/共17页第11页/共17页注意事项

该仪器应放在干燥房间内，使用温度为5℃~35℃。远离强电场、磁场

每次做完实验时，应立即洗净比色皿

为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命

当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记

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比色皿的使用方法

拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污

洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净

比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸蘸干，以保护透光面

第13页/共17页第14页/共17页四、实验步骤

1．样品的制备：

用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。（1）氧合血红蛋白（HbO2）液：加蒸馏水20ml，取全血0.1ml（3滴）盛于小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。

（2）碳氧血红蛋白（HbCO)液：

取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体（浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。

第15页/共17页2．吸光度测定及吸光光谱曲线的绘制：

（1）将如上制备的2种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一次读数均应用空白管调节零点和100%）。（2）先从波长500~600nm分别测定HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。（3）然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于