实验八PCR产品纯化及定向克隆级

实验八PCR产品纯化及定向克隆级第1页/共11页实验八

PCR产品纯化及定向克隆一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的DNA纯化和连接方法；巩固DNA酶切的操作。第2页/共11页二、实验原理

PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影响后续的基因操作，利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反应体系中的酶，然后在酸性条件下用乙醇沉淀DNA。根据实验六所用的PCR引物，其产品的5′和3′末端分别具有EcoRI和NotI酶切位点，而载体pET32的多克隆位点中也有此两个酶切位点。因此，若将PCR产物与载体分别用EcoRI和NotI进行双酶切，所得的产物相应末端正好互补，可用T4DNA连接酶在体外进行连接。第3页/共11页正向引物（P1）

EcoRI5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’反向引物（P2）：

NotI5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’第4页/共11页第5页/共11页三、实验材料与主要试剂1、实验材料

实验二提取的质粒载体pET32

实验七的PCR产品以及实验八的RT-PCR产品2、主要试剂

限制性核酸内切酶：EcoRI和NotI

T4DNA连接酶苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、无水乙醇、70%乙醇等第6页/共11页四、实验步骤1、PCR产品的纯化每组同学的PCR和RT-PCR产品合并，约130μl，转入1.5ml离心管中，向PCR产品中加入150μl苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000rpm离心5min；将上层水相转移至新离心管，加入150μl氯仿，旋涡混合，14000rpm离心5min；再将上层水相转移至新离心管，加10μl醋酸钠和250μl无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置30min；在4℃下14000rpm离心10min，去除上清，观察DNA沉淀。加20μl灭菌水溶解DNA，备用。第7页/共11页四、实验步骤2、PCR产品与载体pET32的双酶切

分别在两个1.5mL离心管中准备双酶切反应混合液。A.10×Hbuffer5μlB.

10×Hbuffer5μl0.1%BSA5μl0.1%BSA5μl

EcoRⅠ2μlEcoRⅠ2μl

NotⅠ2μlNotⅠ2μl

PCR产品20μlpET32载体约2μg

灭菌蒸馏水16μl加灭菌蒸馏水至总体积50μl

将上述两个离心管内的混合物轻轻混匀，37℃水浴酶切3小时。第8页/共11页四、实验步骤3、酶切产品的纯化

酶切后的PCR产品和载体合并(约100μl)，加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000rpm离心5min；将上层水相转移至新离心管，加入100μl氯仿，旋涡混合，14000rpm离心5min；再将上层水相转移至新离心管，加10μl醋酸钠和250μl无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置30min；在4℃下14000rpm离心10min，去除上清；加入500μl70%乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下14000rpm离心5min，去除上清，空气干燥；加8μl灭菌水溶解DNA，备用。第9页/共11页四、实验步骤

4、目的基因(CaM5)与载体(pET32)的连接

在灭菌的PCR管中依次加入：

10×T4DNALigasebuffer1μl

T4DNALigase1μl

PCR产品和pET32