第八章酶免疫技术

第八章酶免疫技术第一页，共六十页，2022年，8月28日第一节酶免疫技术的原理第二节酶免疫技术的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节固相酶免疫测定的技术要点第五节酶免疫组织化学技术第六节其他酶免疫技术第七节酶免疫测定的应用第八章酶免疫技术第二页，共六十页，2022年，8月28日

第一节酶免疫技术的原理

第三页，共六十页，2022年，8月28日主要试剂:

酶标记的抗体或抗原酶标物特点：

免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶促催化反应的高敏感性原理及特点第四页，共六十页，2022年，8月28日特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析

原理及特点第五页，共六十页，2022年，8月28日

第二节酶免疫技术分类

第六页，共六十页，2022年，8月28日酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片中的抗原抗体反应

液体标本中抗原或抗体的定性和定量(ELISA)第七页，共六十页，2022年，8月28日用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定

酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。Ag+Ab-E

Ag-Ab-E+?原理一、均相酶免疫测定第八页，共六十页，2022年，8月28日最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫测定第九页，共六十页，2022年，8月28日EMIT示意图第十页，共六十页，2022年，8月28日CEDIA示意图第十一页，共六十页，2022年，8月28日分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫测定第十二页，共六十页，2022年，8月28日

第三节酶联免疫吸附试验

第十三页，共六十页，2022年，8月28日三个部分：免疫反应酶与底物反应检测方法的建立ELISA酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）高纯度的抗原、高亲和力的抗体高活性、高纯度的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物选用适宜的酶/底物系统分离结合与游离标记物的方法建立操作步骤以及研究自动化测定技术第十四页，共六十页，2022年，8月28日底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理第十五页，共六十页，2022年，8月28日固相的抗原或抗体

酶标记物

酶反应的底物

三个必要试剂

二、方法类型及反应原理第十六页，共六十页，2022年，8月28日双抗体夹心法（doubleantibodysandwich-ELISA）方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的测定。ELISA检测抗原的方法第十七页，共六十页，2022年，8月28日第十八页，共六十页，2022年，8月28日1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY第十九页，共六十页，2022年，8月28日ELISA检测抗体的方法捕获法原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体第二十页，共六十页，2022年，8月28日洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色第二十一页，共六十页，2022年，8月28日第四节固相酶免疫测定的技术要点

试剂的准备反应条件的选择操作的标准化第二十二页，共六十页，2022年，8月28日一、试剂的准备（一）固相载体聚苯乙烯特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性形状：小试管、小珠、微量ELISA板使用前检测其性能（二）抗原和抗体高纯度的Ag高效价的Ab第二十三页，共六十页，2022年，8月28日一、试剂的准备（三）酶和底物的选择标记酶的要求：

活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉第二十四页，共六十页，2022年，8月28日辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶第二十五页，共六十页，2022年，8月28日HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高（小分子醇和尿素的过氧化物）

常用底物第二十六页，共六十页，2022年，8月28日HRP的常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物第二十七页，共六十页，2022年，8月28日OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

HRP的常见底物

第二十八页，共六十页，2022年，8月28日碱性磷酸酶（ALP）

菌源性ALP肠粘膜ALP(小牛)

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

常用酶大肠埃希氏菌

第二十九页，共六十页，2022年，8月28日ALP的底物

β-Gal的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经ALP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物第三十页，共六十页，2022年，8月28日二、酶标记抗体或抗原的方法酶免疫技术的核心组成部分

酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

第三十一页，共六十页，2022年，8月28日抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

制备方法要求第三十二页，共六十页，2022年，8月28日制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原

戊二醛交联法第三十三页，共六十页，2022年，8月28日戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。

第三十四页，共六十页，2022年，8月28日纯化标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

常用的纯化方法：葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯亲和层析效果更好（SPA-IgG;ConA-HRP）二、酶标记物的纯化和鉴定第三十五页，共六十页，2022年，8月28日鉴定质量鉴定（ELISA法直接测定）HRP标记IgG的酶标记率（戊二醛法）酶结合量（mg/ml）IgG量（mg/ml）HRP/IgG摩尔比酶的标记率第三十六页，共六十页，2022年，8月28日四、最适工作浓度的选择(棋盘法)10++1:10001.1710+1:10000.1510-1:10000.091.0++1:1000>21.0+1:10000.261.0-1:10000.120.1++1:10000.420.1+1:10000.140.1-1:10000.1110++1:50000.4610+1:50000.0310-1:500001.0++1:50000.91.0+1:50000.121.0-1:50000.010.1++1:50000.120.1+1:50000.040.1-1:50000.0210++1:100000.1210+1:100000101:1000001.0++1:100000.221.0+1:100000.011.0-1:1000000.1++1:100000.030.1+1:1000000.1-1:100000第三十七页，共六十页，2022年，8月28日五、测定方法的标准化包被加样洗涤孵育结果判定第三十八页，共六十页，2022年，8月28日第三十九页，共六十页，2022年，8月28日第四十页，共六十页，2022年，8月28日理想coating：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附牢固；非特异性吸附较少包被机制1、物理性吸附（被动的）2、共价交联（戊二醛，标准化）影响包被的因素1、包被物质的性质及其浓度2、包被缓冲溶液的pH及离子强度3、包被温度和时间第四十一页，共六十页，2022年，8月28日包被物质的性质及其浓度

聚苯乙烯吸附抗原效果好聚乙烯吸附抗体效果好浓度过高引起前带现象浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭)包被缓冲溶液的pH及离子强度

相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面包被温度和时间

置4℃冰箱过夜，或37℃孵育2h第四十二页，共六十页，2022年，8月28日加样加样量准确加样位置不产生气泡第四十三页，共六十页，2022年，8月28日洗涤

目的1、洗去未结合的物质2、洗去非特异性吸附要求1、每孔充满液体2、去净洗涤液（Tween20）3、冲洗次数和浸泡时间足够4、具有传染性样品必须采用全自动冲洗第四十四页，共六十页，2022年，8月28日孵育

定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的pH和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间，整个过程称为孵育或温育。

方法：干式湿氏推荐温度：37℃

增强作用:聚乙二醇

反应时间:以阳性标本的吸光度值达到1.0时为反应终点第四十五页，共六十页，2022年，8月28日结果判定1、吸光度法（A）2、比例法(A/A0)3、滴度法（倍比稀释样品）4、吸光度直接表示阳性的程度（均一化）5、标准曲线法第四十六页，共六十页，2022年，8月28日第四十七页，共六十页，2022年，8月28日

第五节酶免疫组织化学技术

第四十八页，共六十页，2022年，8月28日酶免疫组织化学技术(enzymeimmunohistochemistrytechnique)定义

在一定条件下，应用酶标抗体或抗原与细胞或普通组织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉淀物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图像分析也可达到定量的目的。种类

1、标记抗体免疫组织化学技术2、非标记抗体酶免疫组织化学技术3、酶标记免疫电镜技术第四十九页，共六十页，2022年，8月28日1、标记抗体免疫组织化学技术第五十页，共六十页，2022年，8月28日第五十一页，共六十页，2022年，8月28日

第六节其他酶免疫技术

第五十二页，共六十页，2022年，8月28日免疫印记法（immunoblottingtest）其他酶免疫技术第五十三页，共六十页，2022年，8月28日生物素-亲和素（BSA）-酶联免疫吸附试验生物素（biotin）-亲和素（avidin）亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。其他酶免疫技术第五十四页，共六十页，2022年，8月28日

第七节酶免疫测定的应用

第五十五页，共六十页，2022年，8月28日ELI