第六章好氧发酵机制

第六章好氧发酵机制第一页，共四十页，2022年，8月28日一.概述有机酸：给出氢离子的有机物。泛指:羧酸（R-COOH）、磺酸（R-SO2OH）、亚磺酸（R-SOOH）、硫代羧酸（R-COSH）种类多：一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸多元羧酸,不饱和羧酸，广泛存在于植物果实中。第二页，共四十页，2022年，8月28日糖、淀粉、酒精、石油等均可经微生物转化生成各种有机酸最早:醋酸和乳酸贾思勰《齐民要术》记载了23种酿醋方法我国已经投产：柠檬酸、葡萄糖酸、长链二羧酸、曲酸等第三页，共四十页，2022年，8月28日二.有机酸应用

1.在食品和饮料中的应用酸味剂:汽水、硬糖、冰淇淋水果罐头、果冻、果酱保色作用抑制腐败微生物生长

2.在医药工业中的应用柠檬酸及钠盐是很好的抗凝血剂葡萄糖酸钙补钙第四页，共四十页，2022年，8月28日3.在化学工业中的应用洗涤剂（脱锈）:无毒、无污染无毒电镀:柠檬酸盐镀锌溶液代替氰化物化妆品、香皂沐浴液:防止氧化和除臭

第五页，共四十页，2022年，8月28日4.其它工业卷烟(乳酸或乳酸钠):防干燥、防霉变、增香处理纤维(乳酸):柔软、光泽显影剂(酒石酸)

乳酸钙是重要的医药和饲料添加剂第六页，共四十页，2022年，8月28日第一节柠檬酸发酵机制柠檬酸（citricacid）,枸橼酸。学名：2-羟基-丙烷三羧酸或-羟基丙三酸分子式C6H8O7

，分子量192.13

无水柠檬酸是无色半透明全对称晶体柠檬酸在化工、医药、食品等方面有广泛的用途第七页，共四十页，2022年，8月28日柠檬酸的生产：

1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。

1893年前，主要从柑橘、菠萝和柠檬等提取

1893年后发现微生物（青霉）可产生柠檬酸

1951年美国Miles公司首先深层发酵法生产柠檬酸（Aspergillusniger）我国20世纪40年代初开始浅盘发酵生产柠檬酸

60年代深层发酵第八页，共四十页，2022年，8月28日柠檬酸生产菌青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉等利用淀粉质原料大量积累柠檬酸国内利用黑曲酶（Aspergillusniger）工艺:固体或液体深层发酵原料:甘蔗渣、废糖蜜、白薯、马铃薯、玉米等第九页，共四十页，2022年，8月28日柠檬酸发酵的原理己糖、淀粉等原料柠檬酸生化过程复杂

EMP糖酵解途径丙酮酸羧化通过三羧酸循环形成柠檬酸第十页，共四十页，2022年，8月28日一、三羧酸循环三羧酸循环TCA环的总反应式为：CH3COSCoA+2O2+12(ADP+Pi)→2

CO2+

H2O

+12ATP+

CoATCA

环产生能量的水平是很高的，每氧化一分子乙酰CoA，可产生12分子ATP。第十一页，共四十页，2022年，8月28日第十二页，共四十页，2022年，8月28日TCA循环的意义：（1）生理意义：在一切分解代谢和合成代谢中占有枢纽地位，在动植物和微生物细胞中普遍存在，不仅是糖分解代谢的主要途径，也是脂肪、蛋白质分解代谢的最终途径，具有重要生理意义（2）实践意义：与微生物大量发酵产物如柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和谷氨酸等的生产密切相关。柠檬酸是葡萄糖经TCA循环形成的最有代表性的发酵产物。第十三页，共四十页，2022年，8月28日二、柠檬酸生物合成途径主要生产菌：黑曲霉第十四页，共四十页，2022年，8月28日TCA循环与柠檬酸的形成

第十五页，共四十页，2022年，8月28日柠檬酸合成中CO2固定系统第十六页，共四十页，2022年，8月28日存在两个CO2固定系统（需Mg2＋、K＋）：

1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强）

2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸第十七页，共四十页，2022年，8月28日三、柠檬酸生物合成的代谢调节（一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节1、正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。第十八页，共四十页，2022年，8月28日第十九页，共四十页，2022年，8月28日2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。锰缺乏时，细胞内NH4＋浓度高，Aa浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过NH4＋升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。第二十页，共四十页，2022年，8月28日（二）、TCA循环的调节

1、TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。第二十一页，共四十页，2022年，8月28日2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断），它被葡萄糖和NH4＋抑止

。（是TCA循环中唯一不可逆的反应步骤）3.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化时所需标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。第二十二页，共四十页，2022年，8月28日第二十三页，共四十页，2022年，8月28日

TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：（1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键（2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力第二十四页，共四十页，2022年，8月28日（3）TCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。第二十五页，共四十页，2022年，8月28日柠檬酸的积累机制第二十六页，共四十页，2022年，8月28日③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。

④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7

同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。第二十七页，共四十页，2022年，8月28日⑤随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。第二十八页，共四十页，2022年，8月28日三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的C4二羧酸只能由乙醛酸提供。第二十九页，共四十页，2022年，8月28日乙醛酸循环第三十页，共四十页，2022年，8月28日第二节、氨基酸发酵机制第三十一页，共四十页，2022年，8月28日一、氨基酸发酵的代谢控制第三十二页，共四十页，2022年，8月28日二、谷氨酸的发酵二、谷氨酸的发酵第三十三页，共四十页，2022年，8月28日1.谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累乳酸积累2.α-酮戊二酸脱氢酶缺失TCA环阻断，α-酮戊二酸积累第三十四页，共四十页，2022年，8月28日3.四碳二羧酸的来源Δ在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶

谷氨酸对糖的转化率达到81.7%ΔDCA循环标志酶：异柠檬酸裂解酶在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充

在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量作用谷氨酸生成期中要封闭DCA环？通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%第三十五页，共四十页，2022年，8月28日4.异柠檬酸脱氢酶活力强提供NADPH,用于还原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系5.氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：α-酮戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP++谷氨酸脱氢酶α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶第三十六页，共四十页，2022年，8月28日生产菌中谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶氨的导入时生物素缺乏，NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度6.谷氨酸合成的调节机制