高效液相色谱详解

高效液相色谱详解演示文稿当前1页，总共40页。优选高效液相色谱当前2页，总共40页。一、液固吸附色谱法

固定相：硅胶：

YWG(无定形)5~6umYQG(球形)3~4um原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物采用来固体吸附剂作为固定相高分子多孔微球：YSG

原理：吸附+分配兼小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物当前3页，总共40页。一、液固吸附色谱法流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---

分离机理:利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱硅胶吸水量↑，LSC→LLC当前4页，总共40页。二、液液分配色谱法

固定相：固定液——极性→NLLC固定液——非极性→RLLC载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC）反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）流动相：各种溶剂当前5页，总共40页。正相色谱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分

分离机理:利用组分在两相中溶解度的差异二、液液分配色谱法当前6页，总共40页。三、反相键合相色谱法

固定相：采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-苯基等流动相：极性较强的溶剂+极性调节剂：一般以水为基础溶剂

例：水+甲醇，乙腈，THF当前7页，总共40页。

分离机理——疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相——硅胶表面的十八烷基“分子毛”——较强的疏水特性。三、反相键合相色谱法当前8页，总共40页。分子中非极性部分——疏水烷基

——缔合作用，分子保留分子极性部分——极性流动相

——离开固定相，减小保留两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为溶质分子：同系物中，碳数越多，K越大引入极性基团，K值变小引入非极性基团，K值变大流动相：流动相的极性增加（增加水的含量），K值变大。溶质的离解程度越高，K值越小。（可加入少量弱酸碱抑制解离，提高分离效果）当前9页，总共40页。改变流动相配比可分离极性化合物用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。

用途

三、反相键合相色谱法

主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物当前10页，总共40页。固定相：采用极性大的氰基或氨基键合相四、正相键合相色谱法流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）+极性调节剂（如氯仿、甲醇，乙醇等）

分离机理：利用溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力当前11页，总共40页。四、正相键合相色谱法用途：多用于分离极性或中等极性化合物流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相：与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等当前12页，总共40页。五、离子键合相色谱法

固定相：硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H、一CH2NH2、－C00H流动相：一般采用缓冲溶液。分离原理：与离子交换色谱类同用途：多用于分离离子形化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等当前13页，总共40页。六、反相离子对色谱法固定相：非极性键合相离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸流动相：极性流动相加入离子对试剂原理：被测组分与流动相中反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离用途：主要用来分离强极性有机酸和有机碱当前14页，总共40页。七、反相离子抑制色谱法固定相：非极性键合相调节流动相pH值，抑制组分解离以改善分离流动相：酸性物质——加入酸HActR↑，k↑

碱性物质——加入碱NH3·H2OtR↑，k↑调节pH范围：3.0~8.0pH>8.0破坏键合相与载体的结合pH<3.0腐蚀柱子离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质、一定pH缓冲液用途：主要用来分离极弱酸碱、两性化合物当前15页，总共40页。八、亲和色谱法（AC）原理：利用生物大分子和固定相表面的生化特异性亲和力进行选择性分离固定相：生物专一性配基+载体流动相：一定pH的缓冲液用途：蛋白、酶、抗体分离生物和医药分析当前16页，总共40页。第四节HPLC分离条件的选择1、涡流扩散项

A：A=2dp

dp—填充物平均直径；—填充不规则因子使用细颗粒固定相球形固定相并填充均匀当前17页，总共40页。2、分子扩散项B/u：B=2Dm—弯曲因子Dm—流动相中的扩散系数流动相是液体，室温操作，Dm小流速在最佳流速以上，u较大

在HPLC中,B/u较小，可忽略即：

H=A+Cu当前18页，总共40页。3、传质阻力项(Cu)使用细颗粒固定相并填充均匀使用低黏度的流动相流速不宜过快:HPLC一般流量为1ml/min左右当前19页，总共40页。dP变小，A、C均变小塔板高度受u的影响也较小4、固定相颗粒dP对柱效的影响影响HPLC柱效的最主要因素

固定相颗粒粒度小的dP是保证HPLC高柱效的主要措施当前20页，总共40页。1、小粒度，均匀的球形固定相2、低粘度的流动相；流速不宜过快3、适当的柱温第四节HPLC分离条件的选择HPLC分离条件：当前21页，总共40页。第五节HPLC的建立与应用一、建立HPLC分析方法的一般步骤

1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。材料来源、浓度范围组分特性、结构、分子量、溶解性等当前22页，总共40页。

当前23页，总共40页。一、建立HPLC分析方法的一般步骤

分离模式选择反相键合相色谱离子抑制色谱离子对色谱液-固吸附色谱2、选择色谱分离模式和色谱柱色谱柱选择固定相类型、粒度、柱长、柱内径当前24页，总共40页。一、建立HPLC分析方法的一般步骤

3、根据样品性质和分析目的选择检测器样品具有紫外吸收特性紫外吸收检测器样品具有发射荧光特性荧光检测器样品无紫外吸收或弱紫外吸收蒸发光散射检测器分析目的：定性分析质谱检测器HPLC-MS当前25页，总共40页。一、建立HPLC分析方法的一般步骤

合适的保留时间和分析速度最佳的柱效和适当的分离度根据分析目的不同，要求的分离度也不同。等度洗脱和梯度洗脱简单样品、单一成分定量：等度洗脱复杂样品、多成分分析或指纹图谱：梯度洗脱4、流动相的选择和优化当前26页，总共40页。一、建立HPLC分析方法的一般步骤

4.分析条件的优化温度流速检测条件进样量当前27页，总共40页。一、建立HPLC分析方法的一般步骤

6、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。制备标准工作曲线精密度试验重复性试验加标回收率试验样品稳定性考察5、建立分析方法并验证当前28页，总共40页。29二、实验技术（一）样品处理1.溶剂萃取HPLC分析通常是使用与水不混溶的有机溶剂从水相中萃取待测的有机化合物。常用有机溶剂：氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁烷等萃取次数：3～5次萃取液处理：合并萃取液，进行蒸发浓缩，在用适当的有机溶剂（如色谱纯甲醇）溶解。当前29页，总共40页。30利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与基体分离，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，适当处理（蒸发浓缩）后用适当溶剂溶解，供HPLC测定。（一）样品处理2.固相萃取二、实验技术当前30页，总共40页。31（一）样品处理二、实验技术3.样品过滤用0.45um的微孔滤膜的样品过滤头过滤。当前31页，总共40页。321.过滤：流动相用0.45μm的微孔滤膜过滤2.脱气：离线脱气、在线脱气二、实验技术（二）流动相处理不能使用腐蚀性的溶剂。如强酸。流动相不能含有任何颗粒。流动相中无机盐的浓度要尽量小(一般几十mmol/L)分析完成要及时用足量的水将缓冲盐冲走，然后用甲醇或乙腈冲洗系统。当前32页，总共40页。33避免压力和温度的急剧变化和任何机械震动样品要进行预处理；在分析柱前安装保护柱流动相要适宜，不能对固定相产生破坏注意色谱柱的pH使用范围、耐压限度注意色谱柱的方向性，色谱柱不能反冲。每次色谱分析完成后，要及时对色谱柱进行冲洗保存色谱柱在合适的溶剂中，一般是甲醇或乙睛二、实验技术（三）色谱柱使用注意事项当前33页，总共40页。34紫外检测器：流动相在测定波长处不能有紫外吸收荧光检测器：流动相不能含有荧光物质或使荧光熄灭的物质蒸发光散射检测器：流动相要易挥发，不含有难挥发的无机盐二、实验技术（四）不同检测器对流动相的不同要求当前34页，总共40页。二、HPLC定性定量分析方法1、定性分析色谱鉴定法：保留时间对照化学鉴定法：利用专属化学反应对分离后收集的组分定性色谱-光谱联用定性非在线色谱光谱联用法：色谱光谱联用仪当前35页，总共40页。二、HPLC定性定量分析方法2、定量分析外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等不需知道校正因子，但需进样量准确内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法当前36页，总共40页。1、在食品分析中的应用食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等；食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。2、在环境分析中的应用多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。三、HPLC的应用当前37页，总共40页。3、在生命科学中的应用分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定三、HPLC的应用当前38页