乳鼠肾细胞的原代培养盛心磊

乳鼠肾细胞的原代培养生92盛心磊2009012337同组成员：王璇实验时间：2012年4月19至4月26实验目的：学习、了解细胞原代培养的一般方法与步骤。掌握无菌操作技术。复习并再次练习细胞的传代培养技术。实验器材与试剂：1.实验器材：超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器、酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培养瓶、离心管等。2.实验试剂：PBS溶液：以成品干粉加超纯水配制；过滤后121ºC灭菌20min，4ºC保存消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液DMEM培养基（含10%胎牛血清及双抗）3.材料：三天左右的乳鼠（每人解剖一只）。实验步骤：消化法：（以下写的是我实际操作时的步骤）将乳鼠（3天左右）断头放血致死。进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中。将肾脏剪成数块，用PBS溶液再洗涤一次。吸去PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀）。加入0.5mL胰酶—EDTA溶液，于37℃消化20～30分钟，直至组织块变白、呈疏松状。加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，反复“吹打”分散细胞。去除大块组织后，1000rpm离心10min；弃上清。加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入到10mL培养瓶中（每瓶1.5mL，每瓶80～100万细胞），37℃、5%CO2培养。取少量细胞悬液（20uL），以PBS溶液稀释10倍后进行计数。1～2日后，更换部分或全部培养液。细胞生长成单层后，即可进行传代培养。整理：取肾后，将鼠尸体置于专门的垃圾袋中。蜡盘、大头针用洗干净后，浸泡于酒精中。小剪刀、小镊子在超净台中，可放置在专用的器械缸中；用毕洗刷干净，按规定放置（216，盆中）。实验结束将废物缸中的物品及平皿丢弃，将废物缸洗净、控干水分，以酒精擦拭后置于超净台中。需要回收的培养皿洗净后放在规定处。肾细胞的传代培养：吸弃原培养基，以PBS溶液洗细胞1-2次；加入200uL消化液，37℃消化3-5min（具体时间根据观察结果决定）；加500uL含10％血清的DMEM培养基终止消化；1000rpm，离心10min（实验中我未进行离心）；加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；按比例分盘，取250uL和450uL分别接在两个新的培养皿中，放在37ºC、5％CO2培养箱中培养；观察记录细胞生长状况并拍照。实验结果：乳鼠肾细胞的原代培养照片：乳鼠组织贴壁细胞乳鼠组织贴壁细胞图1乳鼠肾细胞的原代培养（放大倍数10×40倍）上图表示的是乳鼠肾细胞的原代培养的情况。图中标示出的是贴壁细胞，呈梭形，数量较多。图中较亮的部分不是贴壁细胞，有可能是乳鼠肾脏内的一些结缔组织或脂肪组织。通过观察，我发现培养皿中部分区域都有细胞贴壁的现象，大约占到底面积的50%，因此决定先不传代。在更换培养基后，我将其放在培养箱中继续培养，一天后传代。贴壁细胞图2乳鼠肾细胞的原代培养（放大倍数10×40倍）贴壁细胞如上图，培养皿的大部分区域都已经被贴壁细胞覆盖，覆盖面积大约达到了70%，因此决定进行传代培养。乳鼠肾细胞的传代培养照片图3乳鼠肾细胞的传代培养照片（放大倍数10×40倍）如图所示，左边的图表示的是传代时体积较少的细胞在传代一天后的生长情况。可以看到，细胞数量较多，大部分都已经贴壁，生长良好。总体上而言，较少的这一盘细胞长势很好，底面积的覆盖率大约达到了40%。右图表示的是分盘时细胞较多的一盘。经过一天的培养，底面积的覆盖率达到了70%。图4乳鼠肾细胞的传代培养照片（放大倍数10×40倍）图4表示的是传代2天后细胞较多的一盘细胞的生长情况。该盘细胞密度较大，覆盖率达到了100，而且培养基的颜色发生了变化，由原来的紫色变成了淡红色，说明细胞活性强，生长较快。图5乳鼠肾细胞的传代培养照片（放大倍数10×40倍）图5表示的是传代3天后细胞较少的一盘的细胞的生长状况。如图所示，细胞的生长情况良好，覆盖率也接近100%。两盘细胞的覆盖率都已经达到较高，停止实验。分析与讨论：原代细胞培养每天观察的主要内容：每天需要观察的项目有：培养皿中是否有污染，细胞生长状态，PH（通过培养液颜色变化）。如果发现培养液变为橙红色或是浅红色，且没有出现浑浊的现象，说明细胞生长状况良好。如发现培养液变为黄色且又混浊，表明已被污染，这时细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。在实验结束后我对培养基颜色发生变化的培养皿进行观察（未换液），发现明显的浑浊现象，用显微镜观察，发现细胞形状由梭形变为圆球，细胞逐渐死亡。在没有发生污染的情况下，一般按规24h，可见到许多细胞贴壁，由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状。培养3-4天时，细胞生长繁殖，数量增加，可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展。细胞透明，颗粒少，界线清楚，状态佳。由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时换液一次。2、原代培养的常见问题及注意事项：细胞贴壁状况不好，细胞大量死亡。原因可能是在消化的时候，由于操作时间过长，细胞消化时间也变长，导致细胞膜表面发生变化，导致大量细胞死亡。细胞呈团状，没能分散开。原因可能是剪碎细胞的过程中没能做到很好，造成还有很大的细胞团存在。在实验过程中，我十分注意细胞的分离，用剪刀反复剪细胞团，因此分离较好。培养液中有大量杂质，影响到观察。原因是在剪碎肾的时候，把细胞剪碎，导致有很多细胞碎片，尤其是粘稠状的遗传物质，会影响到实验的结果。在本次实验中确实出现了一些亮度较高的区域，怀疑为细胞碎片或是一些结缔组织。培养几天后，发现有黑点存在。说明当时的无菌操作存在问题，染上了杂菌，这个对细胞的正常生长也是会有影响的。传代后细胞大量死亡。这个是由于小鼠肾细胞的活力不够，在经过传代的胰酶消化后，细胞大量死亡，加之培养环境的改变，细胞不能调整而死亡。3、细胞生长周期：培养细胞的生命期（LifeSpanofCultureCells）大致经历原代培养(primaryculture)期、传代期、衰退期三个阶段，即细胞在培养中持续增殖和生长的时间。

细胞从接种到分离再培养的时间一般称为“一代”，传代细胞的一代生长期分为滞留期(latentphase)、指数生长期(logarithmicgrowthphase)、平台期（stagnatephase）三个阶段。其中指数生长期（又称对数期）为细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多，成倍增长，活力最佳，容易出现接触抑制(contactinhibition)和密度抑制(densityinh-ibition)。细胞分裂指数(mitoticindex，MI)可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要指标，MI即指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数，细胞的MI一般介于0.1%～0.5%，连续细胞系和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。也可通过生长曲线在此期确定细胞的群体倍增时间（populationdoublingtime，PDT）。六、感谢感谢李鹏老师在实验前详细的讲解以及实验过程中的耐心的指导，也感谢各位助教的精心准备和悉心“点拨”。经过本次实验，我学习到了乳鼠细胞的原代培养，进一步练习了传代技术，在此对老师和助教致以最诚挚的谢意！本次实验，我进行传代的细胞“兴奋过度”，活力四射，长势过于凶猛，成为本次实验最健康的细胞。以至于4月25日细胞已经长满培养皿，提前结束了实验。事实告诉我们，只要认真学习，注意操作中的一些细节，细胞传代不是特别困难的。另外