低温诱导的植物基因表达与调控

低温诱导的植物基因表达与调控杭州外国语学校（310023）周筱娟摘要低温是影响植物生长、发育和地理分布的重要因素。近年来，大量研究发现低温诱导许多基因的表达，根据基因表达的蛋白产物，可分为编码功能蛋白基因和调节蛋白基因两大类。本文对这两类低温反应基因的表达与调控及在低温胁迫中作用的最新研究进展进行介绍。关键词：低温反应基因，低温驯化，基因表达低温是影响植物生长、发育及其地理分布的重要环境限制因素之一。大多数热带和亚热带植物由于缺乏对低温的适应能力，当环境温度低于10℃时就会受到伤害，严重影响植物的正常生长、发育甚至造成死亡。分布于温带地区的植物，在温暖季节对冰冻的抗性相当弱。但是，随着季节的变化，气温的逐渐降低，植物对冰冻的抗性也逐渐增强。在非冻的低温环境生长一段时间后，植物增强了抗冻能力，从而能耐受随即发生的冰冻温度，这个适应过程称为低温驯化（coldacclimation）。根据植物的种类，达到最大抗冻性的低温驯化时间从数天至数周不等，不同种类植物可以耐受-10℃至-60℃以下的温度（Webb,Uemura&Steponkus1994）。因此，低温驯化是植物提高抗冻性的有效途径。低温驯化是一个十分复杂的过程。近二十年来，世界各地的科研工作者围绕在低温驯化过程中植物发生的生理生化和分子水平的各种变化进行了大量的研究。最新的研究表明至少有300个低温反应基因参与了低温驯化进程（Fowler&Thomashow,2002）。针对如此复杂的适应过程，低温驯化研究的一个基本目标是分离和鉴定对抗冻性提高起着关键作用的低温反应基因。随着突变分析和分子遗传学方法的大量应用，以拟南芥作为模式植物，已克隆了许多低温反应基因及低温调节的转录因子基因，明确了这些基因的抗冻功能及其涉及的多种低温调控的信号传导途径。根据低温反应基因的蛋白产物可分为两大类：一类是直接保护细胞免受胁迫伤害的功能蛋白；另一类是传递信号和调控基因表达的调节蛋白。1.编码功能蛋白的基因1.1渗透调节物质植物的渗透调节物质主要包括脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖和醇类物质等。在低温和干旱等环境胁迫时，植物通过诱导渗透调节物质的生物合成酶基因的大量表达，增加这类物质的积累，从而调节离子的平衡稳态，维持渗透压的平衡。脯氨酸是水溶性很大的氨基酸，具有偶极性，能通过其疏水端与蛋白质联结，亲水端与水分子结合，从而使蛋白通过脯氨酸束缚更多的水分子，因此可增加蛋白质的可溶性，使更多的可溶性蛋白加入到渗透调节的行列中，同时束缚水含量的增加也能避免或减少因细胞脱水引起的蛋白质变性。研究发现水胁迫过程中同时上调二氢吡咯－5－羧酸合成酶基因（P5CS）和下调脯氨酸脱氢酶基因（ProDH）的表达，导致脯氨酸的积累（Yoshibaetal.1997）。与脯氨酸有关的一个转运体基因（LeProT1）也受水胁迫诱导（Schwackeetal.1999）。大量实验证明通过转化脯氨酸合成酶基因可增强转基因植物的抗脱水和抗冻性。甜菜碱是另一类常见的渗透调节物质，其化学性质与脯氨酸相似，也属于小分子量化合物，具有强的溶解度，在生理pH范围内不带净电荷，对植物无毒害作用，其分布局限于细胞溶质内。甜菜碱具有重要的生理功能，一方面是通过与蛋白的相互作用，保护生物大分子在高电解质浓度下不变性；另一方面，作为渗透平衡物维持细胞的膨压。植物受到低温和干旱胁迫时，甜菜碱醛脱氢酶（BADH）活性增强，BADH基因的表达量增加，从而使甜菜碱大量积累。此外，蔗糖、海藻糖、麦芽糖等可溶性糖和山梨醇、甘露醇等多元醇的冰冻保护作用，主要是通过细胞内的玻璃化状态避免细胞溶液结晶，及保护膜和蛋白质结构。1.2活性氧清除剂大量研究表明低温胁迫诱导植物各种抗氧化酶的积累，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（AsA-POD）、谷胱苷肽－硫－转移酶（GST）和谷胱苷肽过氧化酶等清除氧自由剂。由于植物受到胁迫损伤时，体内活性氧自由基大量积累，导致膜脂过氧化加剧及膜蛋白凝集，质膜通透性增加（沈漫等，1997）。因此抗氧化酶活性和含量的增加，可有效加强低温下植物对膜脂过氧化的自身保护，从代谢水平减轻对细胞的损伤。在提高植物抗冻性研究中，导入抗氧化酶基因（SOD）是目前抗冻基因工程中的一条有效途径。1.3冰冻保护蛋白抗冻蛋白（AFPs）最先发现于极地海洋鱼类中，它能非连续地降低体液冰点，并通过吸附于冰晶的特殊表面有效地阻止和改变冰晶的生长。鱼类AFPs是研究最清楚的抗冻蛋白，而有关植物抗冻蛋白的研究相对较少。现已证明，低温驯化的冬黑麦（Griffithetal.,1992）、雪莲和沙冬青（费云标等，1994）等植物中都有内源AFPs的产生。由于AFPs能影响冰晶的形状和抑制重冰晶，因此它可能对植物抗冻性的提高具有调节作用。目前，抗冻蛋白基因工程的研究大多是将鱼类AFPs基因导入植物，分别获得了抗冻性提高的转基因马铃薯、拟南芥、烟草和番茄等（Kimberlyetal.,1993;黄永芬等，1997）。因此，AFPs是具有显著作用的冰冻保护蛋白。1.4膜脂相的改变大量研究表明，植物细胞内生物膜系统是冰冻伤害的初始位置。Steponkus（1984）研究小组的实验证明冰冻引起的质膜不稳定性包括三种不同的伤害，即膨胀引起的破裂、片层相位到HII相位的相变和断裂突跃伤害。这些变化对与膜结合的各种酶的功能及运输系统具有深刻的影响。许多研究表明膜脂中不饱和脂肪酸成分越高，膜相变温度越低，植物的抗冻性越强。Ristic&Ashworth(1993)报道拟南芥在低温驯化开始6小时内就能观察到质膜超微结构的变化。许多植物在低温驯化过程中都发生了膜脂成分的变化，这种变化与膜的冰冻稳定性相关（Steponkus1984;Uermura&Steponkus1994;Uermura1995）。导入拟南芥的甘油－3－磷酸酰基转移酶基因（GPAT），能使转基因烟草内囊体PG的脂肪酸组成趋于不饱和，明显提高烟草植株的抗寒性（Murataetal.,1992）。将拟南芥编码叶绿体脂肪酸去饱和酶基因（FAD7）转移到烟草，发现烟草细胞中不饱和脂肪酸含量明显升高，在低温条件下转基因烟草的生长抑制明显低于野生型（Kodamaetal.,1995）。1.5冷诱导基因低温驯化诱导了大量新蛋白质的合成，其中大多数既可对低温作出快速反应，又能受ABA和水胁迫的诱导，称为冷诱导基因（cold-inducedgenes）或冷调节基因(cold-regulatedgenesorcold–responsivegenes,cor)。例如拟南芥的COR6.6、COR15a、COR78以及LEA蛋白同源性的蛋白质如COR47。将这些冷诱导蛋白归为一类的主要依据为氨基酸序列的相似性和高度的亲水性特征。此外，许多冷诱导蛋白由相对简单的氨基酸组成（主要由少数几种氨基酸组成），有重复的氨基酸序列基序，且在煮沸条件下仍保持蛋白质的可溶性（Thomashow,1998）。拟南芥的COR15a基因受低温、干旱或ABA诱导表达15-kD的多肽COR15am，它在叶绿体的基质内转变为成熟的9.4kD的多肽，具高度的亲水性和热稳定性。COR15am富含Ala，Lys，Glu和Asp残基，它们的含量超过蛋白质的60％；不含Pro，Met，Trp，Cys，Arg，Gln和His残基；主要由重复的13个氨基酸序列组成。将组成性表达的COR15am基因导入拟南芥，发现转基因植株的叶绿体和原生质体的抗冻性提高1℃－2℃，且增强了原生质体膜的稳定性，但是没有发现对整个植株水平的抗冻性有明显作用（Artusetal.,1996）。其原因可能是低温驯化诱导多个COR基因共同表达并协同作用发挥抗冻作用，如果仅提高其中一种COR的表达是不足以使植物表现出复杂的抗冻性状。LEA蛋白是在种子成熟和发育阶段大量合成的一组蛋白质，在植物的营养体组织中受低温、干旱或ABA诱导表达（Bray,1993）。LEA蛋白的分子量一般为10－30kD，富含甘氨酸和其他亲水性氨基酸，而疏水性氨基酸含量较少。LEA蛋白的特性是高度的亲水性和热稳定性。根据预测的生化特征和序列相似性基序，LEA蛋白可分为几种类型。其中LEAII蛋白，又称脱水蛋白，是目前研究最多的LEA蛋白。HVA1蛋白是大麦在低温驯化过程中诱导表达的一种LEAIII蛋白（Hongetal.,1988），将HVA1基因转入水稻可提高植株对水胁迫和高盐胁迫的耐受性（Xuetal.,1996）。由于抗冻性和抗旱性之间存在许多相似之处，认为HVA1基因是一个候选的抗冻基因。2.编码调节蛋白的基因2.1蛋白激酶蛋白激酶是真核细胞信号传导的重要组分，它们的共同特征是催化区（一般含250—300个氨基酸）都含11个保守的亚区，根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，将蛋白激酶分为丝氨酸/苏氨酸类和酪氨酸类。近期克隆了拟南芥的一些同时受干旱、高盐和低温诱导的蛋白激酶基因，分别编码受体蛋白激酶（receptorproteinkinase,RPK）、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)、核糖体蛋白激酶(ribosomal-proteinkinase)以及转录调控蛋白激酶(transcription-regulationproteinkinase)。植物蛋白激酶通过多重复杂的信号传导途径对干旱、高盐及低温胁迫作出反应，不同传递途径之间存在交叉转导作用（cross-talk）（刘强等，2000）。它们分别在感受外界刺激、参与信号传递、增加蛋白质合成及调控转录等不同方面起重要作用。由此可见，分离与植物干旱、高盐及低温耐性相关的蛋白激酶基因以及研究它们之间的相互作用，将有助于阐明植物对外界环境胁迫的分子反应和信号传递的一些关键步骤。2.2CBF/DREB1转录因子CBF1（C-repeatingbindingfactor,CBF）是拟南芥中能与胞嘧啶重复序列识别的结合蛋白（Stockingeretal.,1997），分子量为24kD，具有一个典型的AP2/EREBP结构域（EREBP/AP2domain）。Jaglo-Ottosen（1998）等将CBF1基因导入拟南芥，不需低温刺激就可诱导一系列COR基因如COR6.6，COR15a，COR47和COR78等的表达，使未经低温驯化的植株就有较高的抗冻性。随后又克隆了CBF1的同源基因CBF2和CBF3，它们和CBF1一起串联排列在拟南芥的第四号染色体上，组成一个小基因家族（Medinaetal.,1999）。实验表明CBF3基因过量表达，可导致COR基因在常温下的组成性表达，并且植株体内脯氨酸和可溶性糖水平增高，使转基因植株的抗冻性和抗旱性都增强（Gilmouretal.,2000）。CBF1,2,3基因受低温诱导而不反应于ABA，是属于不依赖ABA的信号传导途径（Stockingeretal.,1997;Medinaetal.,1999）。2.3其他低温调控基因最近几年，利用化学突变技术已在拟南芥中得到了多个与抗冻性有关的突变体。Eskimo1突变体是一种组成性抗冻（constitutivelyfreezing-tolerant,cft）突变体，在不经低温驯化条件下，esk1突变体能耐受-10.6℃的冰冻温度，比野生型具更强的抗冻性（Xin&Browse,1998）。在esk1突变体中脯氨酸和可溶性糖的含量很高，但是不表达COR基因。表明esk1突变体抗冻性提高与CBFs转录因子调控的下游COR基因表达无关。可见，ESK1是低温信号传导中的一个负调节成分。sfr突变体是拟南芥的冰冻敏感性（sensitivetofreezing,sfr）突变体，它们即使经过2周的低温驯化仍不能完全形成抗冻性（Warrenetal.,1996）。在低温驯化过程中，部分sfr突变体不能积累可溶性糖，其中sfr6不经过CBF1途径诱导COR基因的表达（Knightetal.,1999）。而其他sfr突变体均能强烈诱导COR基因，却依然表现出冰冻敏感性。因此COR基因表达仅是抗冻性形成的一种组成成分。3.展望低温驯化涉及许多低温反应基因表达的改变并引起多种生理和生化变化。虽然很多有利于抗冻性提高的功能蛋白基因已被分离和克隆，然而起着关键性作用的基因及其作用方式仍尚未揭示。尤其对植物细胞如何感受低温胁迫，又如何将这些胁迫信号传递到细胞核中诱导转录因子的表达，并调控下游的各种功能基因的表达等一系列的分子机理所知甚少。因此，开展胁迫条件下转录因子基因的表达及其调控作用的研究，已成为植物分子生物学研究领域的一个前沿内容。参考文献：ArtusNN,UemuraM,SteponkusPL,GilmourSJ,LinCT,ThomashowMF(1996)Constitutiveexpressionofthecold-regulatedArabidopsisthalianaCOR15ageneaffectsbothchloroplastandprotoplastfreezingtolerance.ProcNatlAcadSciUSA93:13404–13409BrayEA(1993)Molecularresponsestowaterdeficit.Plant.Physiol.,103:1035-1040FowlerS,ThomashowMF(2002)ArabidopsistranscriptomeprofilingindicatesthatmultipleregulatorypathwaysareactivatedduringcoldacclimationinadditiontotheCBFcoldresponsepathway.PlantCell14:1675-1690 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