生物化学实验指导手册

实验一从牛奶中提取酪蛋白一、实验目的要求1.学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。2.了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。二、实验原理牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100ml。酪蛋白是含磷蛋白质的混合物，相对密度1.25-1.31，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7.利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH值调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯的酪蛋白。三、原料与器材鲜牛奶、恒温水浴锅、台式离心机、抽滤装置。四、试剂1.95%乙醇2.无水乙醚3.0.2mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液A液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取NaAc.3H2O54.44g，定容至2000ml。B液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g，定容至1000ml。取A液1770ml与B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。4.乙醇-乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1（体积比）。五、操作步骤1.将5ml牛奶置试管或小烧杯中，在水浴中加热至40℃，在搅拌下漫漫加入预热至40℃（应注意两种液体都应先预热至将上述悬浮液冷却至室温。离心分离8min（8000r/min）或15min（2000r/min），弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。2.用蒸馏水洗涤沉淀3次（洗涤时将沉淀颗粒用干净吸管吹开或用毛细管的封闭一端搅开，充分洗涤），离心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），弃去上清液。3.在沉淀中加入3ml95%的乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。4.将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白精制品。5.称取所获酪蛋白的质量（g）。六、计算含量和得率：酪蛋白含量（g/ml）=酪蛋白（g）/50ml×100%；得率=测得含量/理论含量×100%。七、实验注意事项：1.离心管中装入样品后必须严格配平，否则对离心机损坏严重；2.离心管装入样品后必须盖严，并擦干表面的水分和污物后方可放入离心机。3.离心机用完后应拔下电源，然后检查离心腔中有无水迹和污物，擦除干净后才能盖上盖子放好保存，以免生锈和损坏。八、思考题：1.为什么调整溶液的pH可以将酪蛋白沉淀出来？2.试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质的实验。PAGE29实验二凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量一、实验目的与要求：

1.掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。2.掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。二、实验原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。。吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。2NH2-(CH2)2-COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3三、样品：面粉四、仪器与试剂仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000W试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。1.消化试剂：浓H2SO4硫酸铜(固体)硫酸钾(固体)2.2%硼酸(H3BO3)溶液:10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。3.30%NaOH溶液4.0.01mol/L盐酸标准溶液5.混合指示剂:临用时，把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成(比例5：1)．(公用)五、测定方法样品消化：准确称取面粉0.2g左右放入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5gCuSO4、6gK2SO4及25mL浓硫酸，轻轻摇匀后，用消化炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。取50~60mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，以释放潜热，待样品冷至室温，移入250mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。同时做一空白消化（空白消化只加试剂，不加样品）。蒸馏与吸收：加碱加酸加碱加酸（1）将所有的开关打开。从样品加入口加入50mL的蒸馏水，产生蒸汽后，使蒸汽进入反应室，蒸馏洗涤10分钟。然后排出废水。马上从进样口加入蒸馏水约20mL，再次洗涤反应室，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。（2）准确吸取20.0ml样品消化稀释液（或空白液）放入消化管托盘上，按功能键直接加入30%NaOH溶液40.0ml。⑶在250mL锥形瓶内，加入2滴混合指示剂，按功能键直接加入20mL2%硼酸，将冷凝管下端插入到液面以下。（4）从第一滴馏出液滴下开始计时，蒸馏10分钟，将冷凝管尖端提离液面,再蒸馏1分钟，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液流入吸收液内，取下接收瓶。（5）反复洗涤反应室后，再作样品平行测定。测定完毕，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。3．滴定：用0.0100mol/LHCl滴定吸收液至变为紫红色为终点，记下消耗的HCl体积。平行实验进行数次。注意：定氮仪在使用前或每次平行实验后，应用蒸馏水及蒸汽洗涤干净方可进行样品测定的蒸馏操作。洗净的标志：吸收液不变颜色四、计算：公式自己推导。蛋白质%=C—HCl标准溶液的浓度，mol/L；V1—滴定样品吸收液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；V2—滴定样品空白液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；m—面粉的质量，g/mL；0.01401－氮的毫摩尔质量；F—小麦粉的蛋白质含量换算系数为5.70。实验三蛋白质的颜色反应和沉淀反应一、目的：1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应及其机理。

二、原理：(一)蛋白质的颜色反应原理蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。(二)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

三、仪器、试剂和材料1.卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

2.饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g加于1000mL蒸馏水中，在70～80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

3.1%醋酸铅溶液

4.1%硫酸铜溶液

5.0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。

6.浓硝酸：比重1.42。

四、操作步骤(一)蛋白质的沉淀反应

1.盐析作用：取1支试管加入3mL蛋白质氯化钠溶液和3mL饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。

2.乙醇沉淀蛋白质：取1支试管架蛋白质溶液1mL，加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL混匀。观察有无沉淀析出。

3.重金属盐沉淀蛋白质取：2支试管各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。

(二)蛋白质的颜色反应

1.双缩脲反应

①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1mL混匀，观察有无紫色出现。

②另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

注意事项：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察。

2.蛋白质的黄色反应

在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色反应。

3.茚三酮反应

取1mL蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注意：此反应必须在pH5～7进行)。五、思考题：1.能否利用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质的存在？为什么？2.为什么蛋清可以作为铅或汞中毒的解毒剂？实验四蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离一、目的1．学习水解蛋白质的方法。2．掌握纸层析的基本技术。3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。二、原理1．蛋白质的水解蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6mol/L盐酸溶液中将蛋白质在110℃加热大约20h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L-氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。2．纸层析法分离氨基酸纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以Rf值表示：各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的Rf值，借此可以达到定性、鉴别的目的。溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、时间等都会影响Rf值。三、仪器试剂和材料1．仪器（1）干燥箱（2）水浴锅（3）安培瓶（4）层析缸（5）吹风机（6）喷雾器2．试剂（1）6mol／LHCl（2）标准氨基酸（lml／mL）：称取亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸各lmg，分别溶于lml0.01mol／L的HCl溶液中，保存于冰箱（3）展层剂：正丁醇：88％甲酸：水＝15：3：2（V／V）（4）0.5％的茚三酮丙酮溶液（5）10％异丙醇溶液3．材料（1）层析滤纸（10cm×10cm），普通滤纸（21cm×21cm）（2）毛细管、培养皿、镊子四、操作步骤1．蛋白质的水解称取0．Zg酵母粉，放进一个小安培瓶中，向瓶中加入lml6mol／L的盐酸，于喷灯火焰上封口。将安培瓶放入干燥箱内，在110℃下水解20h后，把安培瓶内的水解液倒进蒸发皿内，将蒸发皿放于沸水浴上加热以除去水解液中的盐酸。将水解液蒸干，溶解于0.5—lml10％的异丙醇中。2．纸层析法分离氨基酸取1张10×10cm的层析滤纸放在普遍滤纸上，用直尺和铅笔在距滤纸底边2cm处划一条平行于底边的很轻的直线做为基线。沿直线以一定的间隔做标记以指示标准氨基酸和蛋白质水解液的加样位置。用毛细管吸少量氨基酸样品点于标记的位置上。点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在0.3cm之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复3次，每次的样品点应完全重合。加样完毕后，将滤纸卷成圆筒状，使基线吻合，两边不搭接，用针和线将纸两边缝合。将点好样品的滤纸移入层析缸中（层析缸内事先加入一个注人40ml展层剂的直径为10cm的培养皿，使液层厚度为1cm左右，盖上层析缸的盖子20min，以保证罩内有一定蒸汽压），采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端Icm时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，剪断缝线，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。之后用前三酮丙酮溶液均匀地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤纸放入烘箱，于80℃下显色5min后取出。五、结果处理用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的Rf值，与标准氨基酸的Rf值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。六、注意事项1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。2．点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。4．作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的。且展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。5．如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。七、思考题l．为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？2．影响物质移动速率几值的因素有哪些？实验五：高等植物基因组DNA的提取和纯度鉴定目的意义：DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是

研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的目的是学习植物基因组DNA提取方法、原理和DNA的鉴定技术。Ⅰ、植物基因组DNA的提取（CTAB法）：一、原理：植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/LNaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙

醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。

二、实验材料、仪器及试剂：1、仪器：水浴锅：高速冷冻离心机；移液器；754紫外分光光度计；水平电泳槽；电泳仪2、材料与药品：菠菜叶子离心管；枪头；氢氧化钠；溴代十六烷基三甲胺(CTAB)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；氯仿；无水乙醇；溴酚蓝；异戊醇；β-巯基乙醇；盐酸(HCl)；异丙醇；乙二胺四乙酸(EDTA)3、试剂（1）DNA提取液：2%CTAB缓冲液：2%（W/V）CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris·HCl(PH8.0)（2）异丙醇(-20℃预冷)（3）溶液I：氯仿:异戊醇(24：1)（4）5×TAE缓冲液0.45mol/LTris·H3BO30.5mol/LEDTA(pH8.0)（5）TE缓冲液：10mmol/LTris·HCI1mmol/LEDTA(pH8.0)（6）75%乙醇(放-20℃冰箱中，用后即放回)（7）上样缓冲液：0.25%溴酚蓝三、操作方法：（CTAB法）（1）取10ml的离心管，加入5ml的CTAB提取缓冲液，于65℃恒温水浴锅中预热30min。（2）称取菠菜幼嫩叶片2g置于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，将叶片粉末小心刮入离心管的液体中搅动混匀，在65℃水浴锅中保温30min，其间轻摇几次。（3）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24：1,V/V），轻柔而彻底的混匀4℃下离心（12000/min）20min。（4）将上清液转移到新的离心管中，加2/3体积的异丙醇，混匀，-20℃放置20分钟。4℃离心（12000/min）10min。（5）去上清，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，12000/min离心10min。（6）在沉淀中加入1ml70%的乙醇，轻轻摇晃，12000/min离心10min。（7）在超净工作台上吹干沉淀，但不能完全干燥，将沉淀溶于加有RNAase的200μlTE中。Ⅱ、植物DNA纯度的鉴定——紫外分光光度计法一、原理：由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸

收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。纯度鉴定时，需测定在230、260和280nm处的消光值，经验数据表明，纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。含量测定时，对于纯净的DNA来说，在实际应用中可根据260nm处的消光值O.D260值换算成含量，一般认为O.D260值为1时，相当于50μg/ml。在测定核酸粗制品时，样品中残留的蛋白质和色素等与其它具紫外吸收的杂质对测定有明显干扰作用，大分子核酸制备过程中变性降解后有增色效应，因此有时此法测定的结果会高于定磷法。二、实验材料、仪器及试剂：1、材料：植物DNA2、器材：紫外分光光度计、移液管、试管3、试剂：TE溶液（pH8.0）（见前述）三、操作方法：将纯化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀释至每毫升含5-50μgDNA浓度范围，用TE（pH8.0）作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm和230nm吸收值，计算A260/A230和A260/A280的比值，判断核酸的纯度并换算出核酸的含量。实验六：高等植物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳一、原理:以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛应用于核酸研究中，其操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。DNA分子在高于其等电点的pH溶液带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分

子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就是说与分子大小构象有关。实验表明DNA迁移率与其分子量的对数成反比。因

此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率，可测定样品DNA的分子量。用低浓度的荧光物质，插入性染料溴化乙锭（EB）使凝胶中DNA区带染色，在紫外光

下可直接显示DNA在凝胶中的位置，灵敏度很高，可检出10ng（10-9g）或更少的DNA含量。二、实验材料、仪器及试剂1、材料：植物DNA2、器材：水平板型电泳槽装置；电泳仪；塑料手套；移液器3、试剂：（1）Tris-HAc(TAE)缓冲液：A．浓缩的贮备液（50倍）每升含：242gTris57.1ml冰醋酸，100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）。B．使用浓度：0.04mol/LTris-HAc/0.04mol/LEDTA。（2）琼脂糖：电泳纯以上。（3）0.25%溴酚蓝溶液（4）已知分子量的标准DNA（λDNA-ECORI/HindIII）。（5）10mg/mL溴化乙锭水溶液（EB）三、操作方法：1、琼脂糖凝胶板的制备：称取0.7g琼脂糖置于三角瓶中，加入100mlTAE缓冲液，在沸水浴中加热至琼脂糖完全溶

解，冷却至50℃，然后加入EB溶液使终浓度为0.5μg/ml。倒入凹形有机玻璃槽（事先用胶带封住有机物玻璃板的边缘）。使其成2mm左右的凝胶板。

在其未凝固前将样品槽模板（梳子）插入凝胶的一端，注意梳齿底与凝胶底之间应至少保持0.5-1.0mm的凝胶。待全部凝固后（室温，约30-45分

钟），取出梳子及除去胶带，将凝胶板与玻璃板一起放入电泳槽内，加入TAE缓冲液使刚好超过凝胶面约1mm。2、加样：将样品与溴酚蓝按4：1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔中，点样量为每孔5μgDNA。3、电泳：点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压，如100伏特，这样可使样品很快进入胶内，而减少样品扩散，待样品进入胶内即可保持每厘米5伏特左右的电压，DNA在电泳中向正极移动。当溴酚蓝的区带移至距凝胶底部1-2cm，停止电泳，当胶板为10-15cm的长度时，电泳时间一般为1-1.5小时左右。4、观察与鉴定：电泳结束后，取出凝胶板，在波长为254nm的凝胶成像系统下，观察电泳图谱，如果电泳条带清晰(如果EB染色看到桔黄色荧光条带，GV染色则看到绿色荧光条带)，将凝胶照相。根据标准DNA的电泳图谱，可以得知样品DNA的分子大小。实验七影响酶促反应的因素一、目的要求1．了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。2．学习检定温度、pH、激活剂、抑制剂影响酶促反应速度的方法。二、实验原理在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、pH有密切关系，通常各种酶只有在一定的温度、pH范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、pH值称为该酶的最适温度、最适pH。在酶促反应中，酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂，而硫酸铜则是它的抑制剂。本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中各种因素对其活性的影响。淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精(遇碘呈紫色)→红色糊精(遇碘呈红色)→无色糊精(遇碘不呈色)→麦芽糖(遇碘不呈色)→葡萄糖(遇碘不呈色)。所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断，以此反映淀粉酶的活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的影响。三、实验器材试管和试管架、恒温水浴、冰浴、吸量管（1mL6支、2mL4支、5mL4支）、滴管、量筒、玻棒、白瓷板、秒表、烧杯、棕色瓶。四、实验试剂1．新鲜唾液稀释液(唾液淀粉酶液)：每位同学进实验室自己制备，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5min后使其流入量筒并稀释至200倍(稀释倍数可因人而异)混匀备用。2．1%淀粉溶液A(含0.3%NaCl)：将1g可溶性淀粉及0.3g氯化钠混悬于5mL蒸馏水中，搅动后，缓慢倒入沸腾的60mL蒸馏水中，搅动煮沸1min，冷却至室温，加水至100mL,置冰箱中保存。3．1%淀粉溶液B(不含NaCl)4．碘液：称取2g碘化钾溶于5mL蒸馏水中，再加入1g碘，待碘完全溶解后，加蒸馏水295mL，混匀贮于棕色瓶中。5．1%NaCl溶液6．1%CuSO4溶液7．缓冲溶液系统按下表混合配制。pH0.2mol/L磷酸氢二钠溶液体积/mL0.1mol/L柠檬酸溶液体积/mL5.05.156.057.729.724.853.952.280.28

五、操作步骤1．温度对酶促反应的影响取3支试管编号，按下表进行操作：试管号淀粉酶液体积/mL/℃，5minpH6.8缓冲溶液体积/mL1%淀粉溶液A体积/mL反应温度/℃，10min观察结果123111037～4070左右222111037～4070左右

上述各管在不同的温度下保温反应10min后，立即取出，流水冷却3min，向各管分别加入碘液1滴。仔细观察各试管溶液的颜色并记录，说明温度对酶活性的影响，确定最适温度。2．pH对酶促反应的影响取1支试管,加入1%淀粉溶液(A)2mL、pH6.8缓冲溶液3mL、淀粉酶液2mL，摇匀后，向试管内插入一支玻棒,置37℃水浴保温。每隔1min用玻棒从试管中取出1滴混合液于白瓷板上，随即加入碘液1滴，检查淀粉水解程度。待混合液遇碘不变色时，从水浴中取出试管，立即加入碘液1滴，摇匀后，观察溶液的颜色，再次确认水解程度。记录从加入酶液到加入碘液的时间，此时间称为保温时间。若保温时间太短（2～3min），说明酶液活力太高，应酌情稀释酶液；若保温时间太长（15min以上），说明酶液活力太低，应酌情减少稀释倍数，保温时间最好在8～15min。然后进行如下操作：取4支试管编号，按下表操作：试管号缓冲溶液体积/mL1%淀粉溶液A体积/mL淀粉酶液体积/mL（每隔1min逐管加入）观察结果pH5.0

pH5.8

pH6.8pH8.01234300003000030000322222222

将上述各管溶液混匀后，再以1min间隔依次将4支试管置于37℃水浴中保温。达保温时间后，依次将各管迅速取出，并立即加入碘液1滴。观察各试管溶液的颜色并记录。分析pH对酶促反应的影响，确定最适pH。3．激活剂、抑制剂对酶促反应的影响取3支试管编号，按下表加入各试剂（体积单位：）：试管号蒸馏水淀粉酶液观察结果123222100010001111

将上述各管溶液混匀后，向1号试管内插入一支玻棒，3支试管同置于37℃水浴保温1min左右，用玻棒从1号试管中取出1滴混合液，检查淀粉水解程度(方法同步骤2)。待混合液遇碘液不变色时，从水浴中迅速取出3支试管，各加碘液1滴。摇匀观察各试管溶液的颜色并记录，分析酶的激活和抑制情况。六、注意事项1．加入酶液后，要充分摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，得到理想的颜色梯度变化。2．用玻棒取液前，应将试管内溶液充分混匀，取出试液后，立即放回试管中一起保温。七、问题与思考1．什么是酶的最适温度、最适pH？它们是酶的特征物理常数吗？2．激活剂分几类?氯化钠属哪种类型？硫酸钠对淀粉酶的活性有无影响？实验八小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、目的1．学习分光光度计的原理和使用方法。2．学习测定淀粉酶活力的方法。3．了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。二、原理种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。2（C6H10O5）n＋H2OnC12H22O11麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计法测定。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。三、器材1．25毫升刻度试管。2．吸管。3．乳体。4．离心管。5．分光光度计。6．离心机。7．恒温水浴。四、试剂1.0.1％标准麦芽糖溶液20毫升：精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。2．pH6.9，0.02摩尔／L磷酸缓冲液100毫升3．l％淀粉溶液100毫升：1克可溶性淀粉溶于100毫升0.02摩尔／L磷酸缓冲液，其中含有0.006摩尔／L氯化钠。4．l％3,5-二硝基水杨酸试剂:1g3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔／L的氢氧化钠溶液和50毫升水中；再加人30克酒石酸钾钠，定客至100毫升。若溶液混浊，可过滤。5．l％氯化钠溶液300毫升6．海砂5克五、操作步骤1．种子发芽：小麦种子浸泡2.5小时后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。2．酶液提取：取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳钵内，加海砂200毫克，加1％氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。将提取液离心（l500转／min）6－7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，将酶提取液稀释10倍。取干燥种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照（提取步骤同上）。3．酶活力测定：（1）取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25℃预热10分钟）。将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人10％3,5-二硝基水杨酸溶液2毫升。（2）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。（3）用空白管作对照；在500毫微米处测定各管的光吸收值，将读数填人上表。4．计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准／A未知＝C标准／C未知：则C（酶液管浓度）＝A酶×C标准／A标准式中C代表浓度；A为光吸收值。实验九维生素C的定量测定一、实验目的1.学习定量测定维生素C的原理及方法2.掌握微量滴定法的操作技术二、实验原理维生素C具有很强的还原性，在中性和微酸性环境中，能将染料2，6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型的2，6-二氯酚靛酚，同时被氧化成脱氢维生素C。氧化型的2，6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈现红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。当溶液由无色变为微红色时即表示溶液中的维生素C刚好全部被氧化，此时即为滴定终点。从滴定时2，6-二氯酚靛酚溶液的消耗量，可以计算出被检物质中还原型维生素C的含量。三、器材与试剂器材：1.研钵2.天平3.容量瓶（50ml）4.量筒5.刻度吸管6.锥形瓶（50ml）7.玻棒8.微量滴定管9.漏斗10.新鲜蔬菜或新鲜水果11.滤纸试剂：1.2%草酸溶液2.标准维生素C溶液3.0.02%2，6-二氯酚靛酚溶液四、实验步骤1.提取：称取新鲜样品约4g，置于研钵中，加入5ml2%草酸溶液研磨成浆状，残渣再次研磨，一同转入50ml容量瓶中，草酸总量为35ml，加水定容。2.过滤：提取液充分混匀后，过滤。3.样品滴定：准确吸取滤液5或10ml于50ml的锥形瓶中，立即用标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用染料的毫升数（重复测定2～3次）。4.空白滴定：准确量取35ml2%的草酸，放入50ml容量瓶中，加水定容。准确吸5或10ml于50ml的锥形瓶中，立即用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用染料的毫升数（重复测定2～3次）。5.计算维生素C含量（mg/100g样品）=（V1-V2）VK/W）×100式中：V1为滴定样品所耗用的染料的平均ml数V2为滴定空白所耗用的染料的平均ml数K为1ml染料相当于维生素C的mg数W为样品质量g数注意：标定2，6-二氯酚靛酚：取维生素C标准液5ml及1%草酸溶液5ml于50ml的锥形瓶中，用配制好的2，6-二氯酚靛酚溶液标定。五、实验结果与分析六、复习思考题、作业题：1.VC理化性质最重要的是哪一点？为何用草酸来提取？2.VC的生理功能（生化作用）有那些？3.为了准确测定维生素C的含量，实验过程中应注意哪些操作步骤？为什么？实验十植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）实验目的糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。三、材料、仪器及试剂1．材料：白菜叶、柑桔2．仪器：分光光度计恒温水箱20ml具塞刻度试管（3支）漏斗100ml容量瓶刻度试管试管架剪刀研钵3．试剂：（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验步骤1．葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。管号123456标准葡萄糖原液(ml)(200μg/ml)00.81.0蒸馏水2.01.21.0葡萄糖含量（μg）040801201602002．样品中可溶性糖的提取称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。3．糖含量测定用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。五、结果计算样品含糖量（g/100g鲜重）=查表所得糖含量（μg）×稀释倍数×100样品重（g）×106注意：（1）加浓H2SO4时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。（2）水浴加热时应打开试管塞。实验十一酵母核糖核酸的分离与组分鉴定一、实验目的1、掌握酵母RNA提取的方法。2、了解核酸的组成。3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。二、实验原理：酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2％。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。核酸RNA经酸水解得组分：嘌呤碱、核糖、磷酸并鉴定。三、材料、仪器及试剂1、研钵、锥形瓶、水浴锅、量筒、试管、离心机3000r/min。2、氢氧化钠、无水乙醇、浓盐酸、95%乙醇、无水乙醚（A.R.）、浓硫酸、氨水（A.R.）、硝酸银、三氯化铁、苔黑酚、钼酸铵、抗坏血酸、干酵母粉实验步骤1、用托盘天平称1g干酵母于研钵中，加入少许石英砂，再加入2ml0.04mol/LNaOH溶液，在研钵中充分研磨至少5min。2、再加4ml0.04mol/LNaOH溶液于匀浆液中，混匀后，将匀浆液转移到大试管中，再用4ml0.04mol/LNaOH溶液洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中。3、将大试管小心在沸水浴中加热30min，冷却后倒入离心管中，与另一组同学的离心管在托盘天平上平衡，然后两组的离心管对称地放入离心机中，2000r/min下离心15min。4、吸取10ml酸性乙醇溶液于小烧杯中，将离心管上清液小心倒入小烧杯中，边倒入边搅拌，直到RNA沉淀完全。将小烧杯中的液体倒入2个干净的离心管，平衡、离心（2000r/min）3min。6、弃去两离心管上清液，各离心管中加入95%乙醇2.5ml，振荡、混匀、平衡、离心（2000r/min）3min。7、弃去两离心管上清液，各离心管加入3ml1.5mol/L硫酸，混匀、倒入同一个大试管中，贴上标签，放在试管架上，备用。将水解液在沸水浴中加热至少10min，使沉淀RNA充分水解。9、取一支试管A，加入1ml0.1mol/L硝酸银溶液，再逐滴加入浓氨水至沉淀消失，然后加入1ml水解液放置片刻，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀。10、另取一支试管B，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml（约4滴），混匀，用试管夹夹好后放到沸水浴中3~5min，注意观察溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。11、再取一支试管C，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，混匀，在沸水浴中加热，注意观察溶液颜色的变化，溶液变蓝，说明磷酸存在。注意事项：离心一定要平衡对称放入离心机中，离心机达到设置转速时才能离开。实验结果第6步中离心管底部有不少的RNA沉淀。试管A：出现白色浑浊现象。有嘌呤碱存在。试管B：加热后，出现鲜绿色，且随着加热时间延长，颜色越来越深。有核糖存在。试管C：加热后，出现蓝色，且随着加热时间延长，颜色越来越深。有磷酸存在。说明RNA的组分中有嘌呤碱、核糖、磷酸。分析：本实验选用酵母，是因为酵母中RNA含量较多，且价格便宜。RNA可溶于碱性溶液，所以本实验用0.04mol/LNaOH溶液来提取。RNA不溶于乙醇，可用酸性乙醇使RNA从溶液中沉淀出来，再用乙醇洗涤沉淀，可得到RNA粗制品。研磨和NaOH使酵母细胞破裂，RNA主要存在于细胞质中，所以RNA被释放出来，同时，NaOH使蛋白质变性。加入酸性乙醇，一方面可以中和NaOH，另一方面，使RNA从溶液中沉淀下来。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。（1）、强酸使核酸分子的有机磷消化为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）PO43-+3NH4++12MoO42-+24H+===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O+6H2O当有还原剂（如维生素C）存在时，Mo6+被还原成Mo4+，再与试剂中的其它MoO42-结合成Mo（MoO4）2，呈蓝色，称钼蓝。所以试管C中会出现蓝色。（2）、RNA与硫酸共热，生成的核糖进而脱水转化为糠醛，三氯化铁作为催化剂，可与地衣酚反应，生成绿色化合物，所以试管B中出现绿色。（3）、嘌呤碱可与硝酸银反应产生白色的飘零银化合物沉淀。所以试管A中出现浑浊现象。（4）、不检测嘧啶碱，是因为与嘌呤碱相比，它难以被水解下来，同时它难检测且现象不明显。实验十二脂肪酸的β-氧化一、目的1．了解脂肪酸的β一氧化作用2通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β一氧化作用的方法及其原理。二、原理在肝脏内脂肪酸经β一氧化的作用生成乙酰辅酶A，两分子的乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β一羟丁酸。乙酰乙酸，β一羟丁酸和丙酮总称为酮体。肝脏不能利用酮体，必须经