高中生物选修专题一基因工程

高中生物选修专题一基因工程第一页，共四十九页，2022年，8月28日什么叫基因工程？

基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。（一）基因工程的概念第二页，共四十九页，2022年，8月28日基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→

拼接→

导入→表达第三页，共四十九页，2022年，8月28日（二）DNA重组技术的基本工具分子手术刀—限制性内切酶分子缝合针—DNA连接酶分子运输车—运载体第四页，共四十九页，2022年，8月28日识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶粘性末端平末端第五页，共四十九页，2022年，8月28日什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第六页，共四十九页，2022年，8月28日什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。第七页，共四十九页，2022年，8月28日限制性内切酶特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割。举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，SmaⅠ能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。第八页，共四十九页，2022年，8月28日拓展（EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，在切开后的序列正着读和反着读碱基序列都一样称之为回文序列回文对：

乾隆客上天然居，居然天上客；纪晓岚人过大佛寺，寺佛大过人。第九页，共四十九页，2022年，8月28日二、“分子缝合针”——DNA连接酶1、DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。第十页，共四十九页，2022年，8月28日②DNA连接酶——分子缝合针：E.coliDNA连接酶：只能连黏性末端。T4DNA连接酶：还能连平末端，但效率较低。来源：前者源于大肠杆菌；后者源于T4噬菌体。大肠杆菌T4噬菌体第十一页，共四十九页，2022年，8月28日不同来源DNA片断结合双链断开EcoRI切割第十二页，共四十九页，2022年，8月28日1.作用：

要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。将外源基因送入受体细胞。

3、分子运输车—运载体第十三页，共四十九页，2022年，8月28日2、载体的种类1、质粒：是一种裸露、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子；2、λ噬菌体的衍生物；3、动植物病毒等。第十四页，共四十九页，2022年，8月28日作为运载体必须具备的条件1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具有一个或多个限制酶切割点，便于供外源DNA片段插入。3.具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

3.质粒特点：第十五页，共四十九页，2022年，8月28日三、基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取第十六页，共四十九页，2022年，8月28日一、目的基因的获取1.基因的结构2.目的基因的概念3.目的基因的获取的方法第十七页，共四十九页，2022年，8月28日1.基因的结构（1）原核生物基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游编码蛋白质调控遗传信息的表达（调控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…启动子终止子第十八页，共四十九页，2022年，8月28日编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）启动子终止子真核与原核生物基因结构的比较外显子内含子编码蛋白质（不能编码蛋白质）①相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。②不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。（2）真核生物基因结构第十九页，共四十九页，2022年，8月28日2.目的基因的概念主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。第二十页，共四十九页，2022年，8月28日3.目的基因的获取的方法（3）用化学方法直接人工合成目的基因（1）从基因库中获取目的基因（2）应用PCR技术扩增目的基因第二十一页，共四十九页，2022年，8月28日（1）从基因库中获取目的基因①基因文库和部分基因文库的慨念②基因组文库和cDNA文库的主要区别③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因第二十二页，共四十九页，2022年，8月28日①基因文库和部分基因文库的慨念：

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。

基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库。第二十三页，共四十九页，2022年，8月28日基因组文库的建立方法提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与运载体连接导入受体菌中储存（基因组文库）目的基因分离第二十四页，共四十九页，2022年，8月28日部分基因文库的建立方法mRNA反转录酶单链DNA合成双链DNA（cDNA）

载体插入导入受体菌群（cDNA文库）分离目的基因第二十五页，共四十九页，2022年，8月28日cDNA合成过程

第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。26第二十六页，共四十九页，2022年，8月28日②基因组文库和cDNA文库的主要区别文库类型cDNA文库基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）基因多少物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第二十七页，共四十九页，2022年，8月28日③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因

根据目的基因的有关信息例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。第二十八页，共四十九页，2022年，8月28日（2）应用PCR技术扩增目的基因①定义：②原理：DNA复制

PCR是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因DNA分子热变性（在90～95OC时，解旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之在处)③仪器：PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）④条件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，脱氧核苷酸，酶等。第二十九页，共四十九页，2022年，8月28日④过程：a.DNA热变性（90～95OC)：b.复性或退火（55～60OC)：c.延伸（70～75OC)：d.重复a.b.c步骤：

双链DNA模板在热的作用下，氢键断裂形成单键DNA系统温度降低，引物结合到互补DNA链上，形成局部的双链DNA

在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链DNA每重复一次，目的基因增加一倍PCR扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。第三十页，共四十九页，2022年，8月28日(3)用化学方法直接人工合成目的基因蛋白质氨基酸序列→mRNA的核苷酸序列→目的基因序列→目的基因针对：基因比较小，核苷酸序列又已知推测化学合成推测第三十一页，共四十九页，2022年，8月28日1.目的：二.基因表达载体的构建——核心IMN2.组成：①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。②同时使目的基因能表达和发挥作用。(3)终止子(4)标记基因(2)启动子(1)目的基因

不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。第三十二页，共四十九页，2022年，8月28日质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种基因表达载体的构建33第三十三页，共四十九页，2022年，8月28日三、将目的基因导入受体细胞1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程2.常见转化方法：①农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。（1）将目的基因导入植物细胞③基因枪法：单子叶植物。

②花粉管通道法（3）将目的基因导入微生物细胞—感受态细胞法。（2）将目的基因导入动物细胞——显微注射法。第三十四页，共四十九页，2022年，8月28日①特点:

农杆菌转化法：（1）将目的基因导入植物细胞能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力②过程：Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上③适用生物：双子叶植物、祼子植物。第三十五页，共四十九页，2022年，8月28日基因枪法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法①操作方法：②金属粒：将目的基因导入单子叶植物细胞钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：单子叶植物第三十六页，共四十九页，2022年，8月28日旧式的基因枪靠火药为动力，将子弹头上粘的ＤＮＡ打出。其原理和声音都与鸟枪相仿，成功率仅为千分之八。小图为子弹第三十七页，共四十九页，2022年，8月28日新式的基因枪靠高压氦气为动力，将微粒载片上的ＤＮＡ送出，成功率在１５％左右。小图为微粒载片和阻挡网。第三十八页，共四十九页，2022年，8月28日手提式基因抢第三十九页，共四十九页，2022年，8月28日花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：②特点：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞十分简便经济③例：转基因抗虫棉第四十页，共四十九页，2022年，8月28日①细胞类型：②操作程序：___显微注射法：（2）将目的基因导入动物细胞发育成新性状动物移植到子宫或输卵管培养成早期胚胎显微注射取受精卵（体内或体外受精）提纯含目的基因表达载体受精卵第四十一页，共四十九页，2022年，8月28日倒置显微注射仪德国莱卡公司将目的基因导入动物细胞：第四十二页，共四十九页，2022年，8月28日③常用法：②常用菌：①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少④过程：大肠杆菌Ca2+处理获得感受态细胞Ca2+处理大肠杆菌感

受

态

细

胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA___感受态细胞法（3）将目的基因导入微生物细胞第四十三页，共四十九页，2022年，8月28日四目的基因的检测与鉴定（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交2.个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病结种实验，活性比较实验1.检测方法：分子杂交技术：第四