酶工程(酶制剂制备)

酶工程(酶制剂制备)第一页，共十九页，2022年，8月28日

——（细胞破碎）

——发酵液预处理

——酶液脱色

——酶蛋白的初步纯化与浓缩

——（酶蛋白的提纯与精制）

——酶制剂的成形。CH4.1酶制剂的工业提取方法第二页，共十九页，2022年，8月28日CH4.1酶制剂的工业提取方法

1细胞破碎方法对于胞内酶的提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内的酶蛋白游离出来，常用的破碎方法有以下几种：

1.1机械破碎法：1.2物理破碎法：1.3化学方法：①机械捣碎法：10000转/分。②研磨法：只适合于实验室的小规模操作。③匀浆法：细胞的破碎程度较高，规模小。①温差破碎法：②超声波（>20kHz）裂解法：15-25kHz，100-150W，0-10℃，3-10min；

目前有效的化学方法主要是加入表面活性剂法常用的有：特里顿X-100和吐温（Tween），其主要是破坏细胞膜的结构，增加膜通透性。此法在实验室和生产上已成功应用

第三页，共十九页，2022年，8月28日CH4.1酶制剂的工业提取方法

2发酵液的预处理2.1发酵液絮凝发酵液首先要进行过滤除菌，在发酵液中，由菌体自溶产生的细胞碎片、核酸、杂蛋白等大分子物质，使得发酵液很难过滤；在过滤前必须进行絮凝处理。

发酵液的预处理的常用方法主要是在发酵液中加入絮凝剂，常用的絮凝剂有：聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）磺化聚苯乙烯（PolystyreneSulfonate）；絮凝剂加入，主要有以下三方面的作用：①改变发酵液中悬浮粒子的物理特性，如加大粒子的大小，提高粒子的硬度等；②使一些可溶性的胶体物质变成不溶性的沉淀粒子；③降低发酵液的黏度。

2.2酶液的脱色这一步骤可根据酶制剂的要求而定，一般工业酶制剂允许含有来源中的色素，所以就不脱色；对于医用酶制剂、分析用酶等必须进行脱色处理；目前大部分工业酶制剂都要进行脱色处理过程。常用的脱色剂有活性炭和离子交换树脂。活性炭吸附法，操作效率较高，脱色较彻底，但在脱色的同时，也有部分酶蛋白被吸附掉了；离子交换树脂基本上在脱色的同时，不吸附酶蛋白。

我国生产了一种脱色专用树脂：通用１号脱色树脂。在弱酸性条件下，其吸附色素，而在碱性条件下便释放色素。树脂的再生方便，再生的条件是：先用５％的NaOH洗脱色素，待色素洗脱干净后，用蒸馏水洗到中性，再用5%的HCl（二倍树脂床体积）中和树脂，再用蒸馏水洗到为止。第四页，共十九页，2022年，8月28日CH4.1酶制剂的工业提取方法

3酶蛋白的初步纯化与浓缩

3.1盐析法

[1]盐析的基本原理：蛋白质在水中的溶解度与其所带净电荷的多少呈正相关，即蛋白质的极性越强，其溶解度越大，溶液中的离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋白质的水合程度，降低其溶解度；另一方面，液相中离子的电荷部分地中和蛋白质分子上的电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促使蛋白质析出；此外，溶液中的盐离子引起水分子的极化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。

在盐溶液里，蛋白质的溶解度的对数值与溶液里的离子强度成线性关系，人们总结了以下经验公式：

logS=β-Ks.μS:Protein的溶解度g/l；β为溶液离子强度为零时的logS，

β值受蛋白质性质、盐离子的种类、溶液的温度和pH值的影响；

Ks为盐析常数，因蛋白质而性质和盐离子的种类不同而不同；μ为溶液的离子强度。

[2]盐析的基本方法：蛋白质的盐析方法主要有以下两种：

Ks盐析法：即蛋白质溶液的pH值和温度固定不变，改变溶液的盐浓度（离子强度），以达到沉淀蛋白的作用；此法常用的盐是硫酸铵。

β盐析法：是在一定的离子强度下，改变溶液的pH值和温度，以达到蛋白沉淀的目的。在实际工作中，常用的是Ks盐析法，利用不同饱和度的(NH4)2SO4浓度，这样不同的蛋白质析出沉淀的(NH4)2SO4

浓度不同；通过这种方法可将部分杂蛋白分离出去，达到浓缩酶蛋白的目的。[3]盐析曲线：按盐析经验公式，以中性盐浓度对酶蛋白溶解度作图，得一条如下曲线：盐浓度（饱和度）酶蛋白溶解度盐溶效应：[4]具体操作方法：饱和溶液法:干粉加入法:[5]影响盐析的因素：

温度：

pH：[6]盐析后的脱盐处理透析法：凝胶过滤法：第五页，共十九页，2022年，8月28日CH4.1酶制剂的工业提取方法

3酶蛋白的初步纯化与浓缩3.2有机溶剂沉淀法

除用盐析法沉淀酶蛋白外，还可以用有机溶剂沉淀酶蛋白，目前选用的有机溶剂主要有丙酮和乙醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的价格高，蒸馏回收困难，所以目前多采用乙醇作沉淀剂。

沉淀酶蛋白所需乙醇浓度受很多因素影响，溶液的离子强度、温度、pH值等都影响蛋白质的析出，低浓度的盐离子有促进蛋白质溶解的作用，即所谓的盐溶效应；所以当溶液中有低浓度盐离子时，乙醇的浓度要增加；温度升高蛋白质的溶解度增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇浓度增加；pH值的影响因不同的蛋白质而不同，一般情况下，当溶液的pH值与酶蛋白的等电点一致时，需要的乙醇浓度最低，偏离酶蛋白的等电点越远，酶蛋白所带电荷越多，蛋白质的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇浓度越高。一般作为沉淀剂的乙醇浓度是95%，沉淀不同的酶蛋白需要乙醇量稍有差异。如沉淀枯草杆菌的淀粉酶发酵液时，要求乙醇浓度为：每体积的发酵液加0.2—0.8体积的乙醇；当沉淀蛋白酶时，加0.8—1.1体积的乙醇沉淀出的主要是中性蛋白酶，加1.1—1.4体积的乙醇时，沉淀出的主要是碱性蛋白酶。对于每一种酶蛋白的沉淀要求乙醇的适宜浓度需要实验确定。第六页，共十九页，2022年，8月28日CH4.1酶制剂的工业提取方法

3酶蛋白的初步纯化与浓缩3.3

喷雾干燥法

此法是利用喷雾干燥技术，直接将液态酶浓缩成固体酶制剂，此法的生产效率较高，工艺过程简单，但此法在生产应用上有一定的局限性，在喷雾干燥时，需要一定的温度，在喷雾塔里面进如一定温度的热空气，对于那些对热不稳定的酶蛋白不宜使用，现用在生产的主要是生产α-淀粉酶。3.4膜分离技术除上述经典的浓缩方法外，目前膜技术的发展已应用到酶蛋白的浓缩和分离上来了，膜分离技术是以一定孔径的高分子膜作为过滤介质，将不同大小、不同性状、物质颗粒或大分子进行分离的技术。膜分离技术所使用的膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢、尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。在膜分离过程中，膜的作用是有选择性地小于其孔径的颗粒通过，将大的颗粒截留，根据欲分离的物质颗粒的大小，选择不同孔径的膜。

根据物质颗粒通过膜的原理及和推动力的不同，膜分离技术可分为以下三种：①加压膜分离加压膜分离是以膜两侧的流体静压差为动力，推动小于膜孔径的颗粒通过膜孔，大于孔径的颗粒被截留。根据膜孔径大小范围又分为超滤、微滤和反渗透三种。

超滤：即超过滤，本技术过滤截留的颗粒直径在20—2000A（0.2μm)相当于分子量1000—5×105Da,并且有多种规格供选用。此法主要用于酶蛋白的浓缩和部分纯化分离，此外，在生化药业也常被采用。此技术采用的滤膜是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜，膜由两层构成，分表层和基层，表层是滤膜的有效层，其厚度为0.1—5μmμm，孔径大小有多种规格，现有20—2000A的系列产品销售；基层为支持层，主要负责膜的强度，其厚度为200—250μm具有坚韧的强度。影响超滤的因素：膜的过滤效果用膜的流率来表示，即每平方厘米膜每分钟滤过的流体量，以ml./cm2.min表示，影响流率的主要因素有膜孔径的大小、颗粒性状、溶液的黏度、流体静压。根据上述影响因素，可在一定范围内增加流体静压（一般控制在50—700kPa)、适当提高溶液温度、增加溶液的搅拌述度都可在一定程度上提高膜的流率。超滤技术在目前无论是实验室研究还是酶制剂的工业化生产应用都非常广泛，其操作简单，工作效率高，但对于那些有小分子辅酶的酶制剂不宜采用此技术。

微滤：又称微孔过滤，其孔径较超滤膜的孔径大，一般在0.2—2.0μm范围，主要用于过滤去除细菌及其它显微镜下可见的颗粒物质，此法在酶蛋白的浓缩和分离方面不用，主要勇于矿泉水、无菌水、软饮料生产方面除菌和除去不溶性颗粒物质。

反渗透：反渗透膜的孔径最小，一般在20A，截留分子量为1000D主要用于分离各种离子和小分子物质，此技术主要用于生产纯水，海水的淡化等。

②电场膜分离：将膜分离装置置于电场下，被分离的物质在电场的作用下，借助电场力作为推动力，以达到分离的目的。利用电场膜分离的物质，必须具备一个基本条件，那就是其必须是带电粒子，如果其不带电荷，或其静电荷为零，这样的粒子就不适宜用此法分离。常用的有以下两种方法：

电渗析：在一个电渗槽内，用两块半通透膜隔成三个室，中间室装待分离液，两侧室装水或缓冲液，并装有电极，接通电源后，带正电荷的粒子向负极渗透，而带负电荷的粒子向正极渗透，从而达到分离的目的。此法多用于酶液的脱盐，去除杂质等。

离子交换膜电渗析：其装置与电荷风析一致，只是所用的膜较为特殊，两块膜上带有带电基团，且电性相反，使得带相同电荷的粒子不能靠近膜，不致于影响膜的通透性。其应用范围与电渗析一致，当溶液的浓度较高时，此法工作效率更高。③扩散膜分离：扩散膜分离主要是指透析方法，将酶溶液装在由扩散膜制成的透析袋中，再将透析袋置于扩散介质（缓冲液）中，溶液中的小分子就通过膜扩散出来，大分子被截留在袋内。此法主要用于没蛋白的脱盐；另外此法还可用于酶蛋白的浓缩，当浓缩酶蛋白时，是用高浓度的吸水性较强的扩散介质，常用的有甘油、聚乙二醇（粉剂）等。第七页，共十九页，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提纯与精制

一般情况下，工业上用的大多是经过初步提纯和浓缩即可制备成酶制剂；对于多数医用酶制剂或分析用酶制剂或生化试剂等，则需要进行高度提纯和精制；另外对于开发出的新的酶制剂，在投入规模化生产前，为研究其各种酶蛋白特性和酶学特性，也需要将酶进一步提纯和精制。

酶蛋白提纯的经典程序包括：离子交换层析——分子筛过滤层析——电泳检测纯度（必要时可进行制备电泳分离）第八页，共十九页，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提纯与精制

1离子交换层析法

（1）离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上某些极性基团，通过极性基团的静电吸附作用，对极性大分子进行分离。按离子交换剂上的活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。阴离子交换剂：

当离子交换剂携带阳性基团，用来吸附阴离子时，交换剂称为阴离子交换剂。

目前常用的阴离子交换剂有：

DEAE～纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）

DEAE～纤维素适宜用来分离分子量在10,000-100,000或以上的蛋白质，其稳定性好，装柱后，在洗脱过程中，柱床体积基本保持不变，交换容量大，每克交换剂可吸附0.1—1.1毫克酶蛋白。

DEAE～SephadexA50

DEAE～SephadexA50的交换容量更大，（5.0毫克/克交换剂），但其有一最大的局限性，就是在洗脱过程中，随着离子强度的增加柱床体积变小，影响分离效果。

AE～纤维素（氨基乙基纤维素）阳离子交换剂：

阳离子交换剂有：

CM～纤维素（CM－C，羧甲基纤维素）。弱酸性阳离子交换剂。磷酸纤维素（P－C）

中酸性离子交换剂。第九页，共十九页，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提纯与精制

1离子交换层析法（2）离子交换分离酶蛋白的基本原理：

一般情况下，酶蛋白的等电点在pH7以下，所以在偏碱性溶液中，酶蛋白带负电荷，所以多用阴离子交换剂；（有些酶蛋白等

电点较高，可以将其置于偏酸性溶液中，这样酶蛋白就带正电荷，分离纯化时应选用阳离子交换剂）。在同一pH条件下，由于不同的蛋白质所带电荷不同，其与交换剂的亲和力不同，通过梯度增加洗脱剂的离子强度，按蛋白质与交换剂亲和力的由小到大，依次被洗脱下来，达到分离的目的。第十页，共十九页，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提纯与精制

1离子交换层析法

离子交换拄层析基本程序及要点：（以DEAE～纤维素为例）

①离子交换剂的处理：首先将DEAE～纤维素用蒸馏水浸泡溶涨，然后按：0.5N盐酸处理30分钟以上（不断搅拌）→蒸馏水反复洗涤致中性→0.5N氢氧化钠处理30分钟（不断搅拌）→蒸馏水洗涤致中性。

②洗脱液pH的确定：采用pH梯度测定。按10％交换当量加入离子交换剂和酶蛋白振荡保温20－30min静止后，测定上清夜的酶活力到没有酶活力测出的试管pH＋1，即为离子交换洗脱液的最适pHpH1pH2pH3pH6pH5pH4pH7④平衡：装柱后，用洗脱液进行平衡过夜，流述稍大于洗脱流述，使流出缓冲液的pH与流入的相同。⑤上样和平衡：为达到良好的分离效果，上样量一般为其交换容量的10—20%，样品的pH值和离子强度应与洗脱液一致。上样后用洗脱Buffer平衡。洗脱曲线：⑦分部收集：利用自动分部收集器收集。⑥洗脱：上样后，首先用平衡洗脱液洗脱，主要是洗脱下那些与交换剂结合力很小或不结合的杂蛋白；然后，通过改变洗脱液的离子强度进行梯度洗脱梯度洗脱公式为：

Ｃ=C2－(C2－C1)(1－v/V)A2/A1C2：洗脱液的极限离子浓度；C1：初始离子浓度；

v：洗脱液流出体积；V：贮液室和混合室的总体积；A2：贮液室的截面积；A1：混合室的截面积；

当A2/A1等于1时，上述公式代表一个直线梯度变化；当小于1时，为凹形梯度变化；当大于1时，为凸形梯度变化。

③装柱：将交换剂搅拌悬浮起来，抽气处理，然后用倾倒法装柱。(8)收集与浓缩第十一页，共十九页，2022年，8月28日CH4-2酶蛋白的提纯与精制

2分子筛层析法（1）分子筛层析法基本原理

凝胶过滤法是以不同蛋白质的分子量大小差异来将不同蛋白质分开的方法。最常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex),是由葡聚糖和3-1,2环氧化丙烷（交联剂）相互交联而成的中央带有微孔的球状凝胶颗粒，根据凝胶分子的交联程度的不同，共有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等8种型号，G50以下的为硬胶，G75以上的为软胶。G10的交联度最高，分子内的网孔最小；G200的交联度最低，分子内网孔最大。根据蛋白质分子大小不同，在通过层析柱时，走的路程不同，从而分开。

（2）凝胶的选择：

G25以下主要用于脱盐和氨基酸，或用于分离分子量在5000以下的小肽。

G50主要用于分离分子量1500—30000的小分子蛋白。

G753000—80000G1004000—150000G1505000—300000G2005000—600000（3）凝胶的溶胀：

凝胶规格融胀体积（ml/g)时间/h.20C时间/h.90-100CG102－331G152.5-3.531G254-631G509-1131G7512-15243G10015-20723G15020-30725G20030-40725

(4)装柱：装柱前必须进行凝胶脱气处理，装柱要求同离子交换层析

（5）装柱效果检测：

用带有颜色的大分子上样，然后洗脱，检测样品走柱的介面效果，常用蓝色葡聚糖－2000。

（6）上样：

和离子交换层析有根本不同。主要考虑上样体积，一般控制在1％－10％。视具体情况而定。

（7）洗脱

洗脱剂可以用低浓度Buffer，也可用蒸馏水；在洗脱过程中，主要控制两个参数：流速和有效操