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文档简介

淀粉酶的分离与纯化（上）

浸提、盐析、透析、浓缩

一、实验目的

1、掌握蛋白质分离纯化的一般程序。2、掌握盐析、透析、浓缩的基本原理与操作。二、实验原理

蛋白质作为溶液稳定存在的两大因素：

1.蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；

2.蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。三、仪器与试剂1、缓冲液：0.05M磷酸氢钠缓冲液（PH7.0），含5mmol/l2-巯基乙醇，1mmol/lEDTA,0.5mmol/l，PMSF。2、仪器：离心机，量筒，研钵，四、实验内容（一）浸提

采用缓冲液从固态粗酶粉中浸提粗酶液。称取粗酶粉2.5g，加入20ml缓冲液，研磨5-10min，3500rpm离心分离10min，收集上清液。为提高收率，沉渣可加入适量缓冲液再浸提1~2次，离心，合并上清液，即为粗酶液，测定体积。测定粗酶液的酶活力，计算总酶活1(酶活力×体积)收集每一饱和度下沉淀出的蛋白质（沉淀A,B,C），分别用5ml的缓冲液溶解.测定组分A,B,C的酶活力和蛋白质浓度，以确定淀粉酶主要存在于哪一级的沉淀中，并计算组分B的收率。如果需要，可将采用更细的分级。组分B的收率=（B的酶活力×B的体积）/总酶活1×100%（三）透析1、透析袋的预处理：

透析袋的处理主要是除去污染物，特别是重金属和蛋白酶等对蛋白质有毒害作用的物质。可在0.1mol/l的EDTA溶液中煮30min，再换用蒸馏水煮7次，每次20分钟。2、透析：

将所收集的具有酶活力的组分（组分B），放入透析袋，置于清水中，电磁搅拌，透析24h，中间换水3-4次。为了防止酶失活，整个透析系统应低温放置。

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