沙门氏菌检测技术应用第四组

contents沙门氏菌生物形态简介1沙门氏菌生理生化特性2沙门氏菌检测技术的应用3第一页，共43页。沙门氏菌（Salmonella）形态一群形态、培养、生化反应和抗原构造相类似的杆菌，种类繁多。已发现2500多种血清型，我国目前发现的有200多种血清型。第二页，共43页。

沙门氏菌主要生物学性状

革兰氏阴性短杆菌，无芽孢和荚膜，有鞭毛（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外），大多数具有毛。需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上生长良好。7-45℃均可生长，最适温度37℃，最适。第三页，共43页。沙门氏菌生物学特性发酵葡萄糖，麦芽糖，甘露醇和山梨醇产气不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇不产吲哚、V-P反应阴性

不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨

第四页，共43页。血清学特性与传播途径O抗原

Vi抗原H抗原第五页，共43页。DHL:无色半透明有黑色中心或几乎全为黑色酚红黄绿：菌落呈红色透明，同时培养基颜色变红HE：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色科马嘉显色培养基：呈紫色或紫红色沙门氏菌在不同选择琼脂平板上的菌落特征第六页，共43页。国内现行标准分子生物学方法免疫学方法传统检测方法GB/T13091-2002（培养法）GB/T4789.4-2010（培养法）GB/T29642-2012（PCR法）SN/T1059.7-2010（实时荧光PCR法）GB/T22429-2008（酶联免疫法）DB34/T816-2008（免疫色谱反应法）第七页，共43页。

沙门氏菌检测技术1传统检测方法2分子生物学方法3免疫学方法4代谢学技术第八页，共43页。

主要培养基、试剂、血清缓冲蛋白胨水（BPW）氯化镁-孔雀绿增菌液（RV）亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）酚红黄绿琼脂DHL琼脂营养琼脂色氨酸肉汤赖氨酸脱羧酶肉汤尿素酶氰化钾培养基甘露醇山梨醇Β-半乳糖苷沙门氏菌O，Vi，H型血清第九页，共43页。

主要仪器设备与材料高压灭菌锅干热灭菌箱培养箱水浴锅接种环培养瓶或三角瓶量筒平皿第十页，共43页。25g样品225ml

BPW36℃16-20h1mlBPW增菌液+10mlSCMM增菌液在42℃、SC增菌液在36℃各培养24h0.1mlBPW增菌液+10mlMM分别从MM和SC增菌液中取1环，接种到酚红黄绿和DHL琼脂上培养在36℃培养20-24hDHL琼脂在36℃培养24h分别选择性培养基上挑选可以菌落进行TSI等生化鉴定第十一页，共43页。底层产H2S底层产酸斜面产碱斜面底层产酸产碱底层产酸斜面产碱底层产H2S产酸产气产酸产气产H2S只在TSI产碱的情况下可判定无沙门氏菌，其余任何情况均需进行生化鉴定TSI生化试验第十二页，共43页。生化鉴定O.5个麦氏浊度的菌悬液依次在每个安瓿瓶中滴加菌悬液2～3滴。第一步第二步第三步第十三页，共43页。

生化鉴定试剂套装色氨酸肉汤经36℃，18～24h培养后滴加靛基质试剂，片刻观察结果，阳性为玫瑰红色色氨酸脱羧酶及对照和氰化钾及对照转种结束后需滴加液体石蜡覆盖试验管方可进行培养靛基质试验+时补做甘露醇山梨醇试验，试验阳性后进行血清学鉴定TSI-时，进行ONPG试验，ONPG阴性时进行血清学鉴定H2S+、靛基质-、尿素-、KCN-、赖氨酸+后进行血清学鉴定第十四页，共43页。

结果判定第十五页，共43页。

血清学鉴定

阴性阳性

第十六页，共43页。GB/T29642-2012

饲料中沙门氏菌的快速检测方法-聚合酶链式反应（PCR）法SN/T1059.7-2010进出口食品中沙门氏菌检测方法-实时荧光PCR法

现行标准第十七页，共43页。

PCR技术是是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA目的片段进行短时间内大量扩增的技术。PCR技术原理第十八页，共43页。25g样品225mlBPW36℃16-20h1mlBPW增菌液+10mlSCRVS增菌液在41.5℃、SC增菌液在36℃各培养24±3h0.1ml

+10ml大豆蛋白胨肉汤（RVS）煮沸离心PCR扩增电泳检测GB/T29642-2012---第十九页，共43页。

主要仪器设备、培养基、试剂PCR仪离心机微量移液器电泳仪凝胶成像仪分析天平缓冲蛋白胨水大豆蛋白胨肉汤亚硒酸盐胱氨酸增菌液引物PremixTaqDNA聚合酶琼脂糖Marker2000TAE缓冲液溴化乙锭（EB）---GB/T29642-2012第二十页，共43页。DNA模板制备方法方法一：热裂解法取选择性增菌液1ml于离心管中，12000r/min离心10min，灭菌去离子水洗涤2次，最后用0.2ml灭菌去离子水悬浮，煮沸10min，将离心管迅速转移至冰浴中冷却，10000r/min离心5min，取上清液作为模板。方法二：试剂盒可选用商业试剂盒。---GB/T29642-2012第二十一页，共43页。PCR扩增

反应体系

反应程序

---GB/T29642-2012第二十二页，共43页。PCR结果分析及判定结果判定：在阴性对照无条带，阳性对照有条带的前提下，如果待测样品再330处未出现相应大小的扩增条带，则可报告未检出沙门；如果待测样品在330bp处出现扩增条带，则为疑似阳性样品，需用GB/T13091进行确证，最终结果以后者为准。---GB/T29642-2012第二十三页，共43页。实时荧光PCR原理实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过阳性对照、Ct值及扩增曲线对模板进行定性分析的方法。第二十四页，共43页。25g样品225mlBPW36℃16-20h1mlBPW增菌液+10mlSCRVS增菌液在41.5℃、SC增菌液在36℃各培养24±3h0.1ml

+10ml大豆蛋白胨肉汤（RVS）煮沸离心反应体系扩增曲线

实时荧光PCR法第二十五页，共43页。主要仪器设备、培养基、试剂荧光定量PCR仪离心机微量移液器恒温水浴锅高压灭菌锅缓冲蛋白胨水亚硒酸盐胱氨酸增菌液四硫磺酸钠孔雀绿增菌液引物探针DNA提取试剂盒TaqDNA聚合酶---SN/T1059.7-2010第二十六页，共43页。模板DNA的制备

方法一：热裂解法

取增菌液1ml，置于离心管中，5000r/min离心5min，灭菌生理盐水洗涤2次，最后用1ml灭菌去离子水悬浮，煮沸15min，10000r/min离心5min，取上清液作为模板。方法二：试剂盒法

参照美国Promega公司生产的DNA抽提试剂盒，或其他等效产品操作程序进行。---SN/T1059.7-2010第二十七页，共43页。实时荧光PCR扩增反应体系（25ul）反应条件10×PCR缓冲液2.5uldNTPs1ul上游引物1ul下游引物1ul探针1ul模板2ulTaqDNA酶0.5ul双蒸水16ul1个循环95℃10min40个循环95℃15s65℃30s---SN/T1059.7-2010第二十八页，共43页。样品Ct值≤35时，报告沙门氏菌筛选阳性；样品Ct值介于35-40之间，重复一次，如果Ct值＜40，且曲线有明显的对数增长期，报告沙门氏菌筛选阳性，否则，报告未检出；样品Ct值≥40时，报告未检出。筛选阳性的样品按SN0170的规定进行确证，以确证结果为准。

结果分析及判定---SN/T1059.7-2010第二十九页，共43页。

其他分子生物学技术环介导等温扩增技术（LAMP）多重PCR技术基因芯片技术第三十页，共43页。

免疫学方法第三十一页，共43页。

现行标准GB/T22429-2008食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验（酶联免疫法）DB34/T816-2008饲料中沙门氏菌的测定（免疫色谱反应法）第三十二页，共43页。技术原理

免疫学检测是基于免疫学理论基础，根据抗原抗体的特异性反应而进行检测的技术。沙门氏菌特异性抗体是快速定性检测的基础。第三十三页，共43页。主要仪器设备、培养基、试剂酶联免疫分析仪漩涡混合器均质器恒温培养箱高压灭菌锅缓冲蛋白胨水氯化镁孔雀绿增菌液亚硒酸盐胱氨酸增菌液四硫磺酸钠孔雀绿增菌液沙门氏菌酶联免疫试剂盒---GB/T22429-2008第三十四页，共43页。

检测步骤

前增菌和增菌：按GB/T4789.4中处理。移取1ml增菌液到灭菌小试管中，煮沸15min，剩余增菌液于4℃保存，以便用于阳性确认。取沙门氏菌酶联免疫试剂盒，与15-30℃的环境中放置30min。取适量煮沸后的增菌液加入试剂盒测试孔中，按照试剂盒说明进行操作。---GB/T22429-2008第三十五页，共43页。

结果判定经过酶联免疫过程后，将检测反应强度（荧光强度或吸收度），与参照值比较，得出检验结果。---GB/T22429-2008第三十六页，共43页。

电阻抗技术

原理：细胞在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的大部分电惰性物质，代谢为具有电活性的小分子物质，其能增加培养基的导电性，使阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化来判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。应用：沙门氏菌检测、菌落总数测定、细菌类型（霉菌，大肠杆菌，酵母菌，沙门氏菌等）检测

第三十七页，共43页。

同时做对照实验，同时绘制阻抗曲线图，

通过与计算机内标准谱图对比，来确定细菌的类型和数量

细菌置于培养基中，将不带电的大分子

(如蛋白质、脂肪、碳水化合物)

带电荷小分子化合物(如胺类、尿素)测定电阻抗岁时间的变化情况绘制阻抗曲线图第三十八页，共43页。

国标方法优缺点传统检测法周期长，需要4-7d，过程繁琐、费时费力；传统培养基选择性和特异性存在一定局限性，柠檬酸菌属、变形杆菌等均可能对沙门氏菌的检测产生干扰，造成假阳性。PCR技术快速准确，结果分析简单，对样品要求不高，检测时间短；但与传统培养法相比，操作复杂，残留污染易导致假阳性，对技术人员要求较高，需要专用仪器设备。ELISA法具有灵敏度高、检测速度快等优点，但费用较高，需要专用仪器。第三十九页，共43页。

非国标方法优缺点实时荧光PCR法具有高度的灵敏性、特异性和精确性，与PCR方法相比，具有操作简单、所需时间短等优点，但成本较高。第四十页，共43页。

参考文献

孙雨.卜仕金.王美君.沙门氏菌的毒理作用机制及其检测方法的研究进展[J].口岸卫生控制.2009(02)

刘晓霞.关于食品中沙门氏菌快速检测方法的新进展[J].化学工程与装备.2009(10)吴珊珊.病原微生物检测技术研究进展[J].职业与健康.2016(09)陈雯雯.段文峰.刘洋.新技术在食品微生物检验检测中的应用[J].上海师范大学学报.2016(