大赛璐手性分析方法筛选与优化 (2)课件

业界之最享誉全球手性分析方法筛选与优化主要内容手性色谱基础和大赛璐手性柱涂布型正相手性分析方法开发涂布型反相手性分析方法开发化学键合型手性分析方法开发常见手性分析问题与注意事项液-液萃取法生物催化法不对称合成法膜分离法传感器法结晶法毛细管电泳色谱法手性分离方法手性色谱技术方法精度说明旋光法低

(5%)

非对映体异构体法

高

(0.1%)几十毫克.ＮＭＲ中等

(2%)几毫克需要位移试剂.色谱法高

(0.1%)微克-毫克HPLC、GC、SFC对映体纯度测定方法及其比较几十毫克样品用量需要其它的手性化合物来制备非对映体需要真实样品手性色谱固定相法基本原理

操作简单

不需要预处理

准确度高即可用于对映体的常规分析，也可实现大规模制备RR对映体分离示意图SSSSSSSSSSR,S消旋体(racemate)手性选择剂RSRRRRRRRR引入手性环境是实现手性分离的前提Daicel手性色谱柱一览表正相直链淀粉衍生物

CHIRALPAK®

AD/AD-H/AD-3

CHIRALPAK®

AS/AS-H/AS-3

CHIRALPAK®

AY-H/AY-3

CHIRALPAK®

AZ-H/AZ-3纤维素衍生物

CHIRALCEL®OD/OD-H/OD-3

CHIRALCEL®

OJ/OJ–H/OJ-3

CHIRALCEL®

OZ–H/OZ-3

CHIRALCEL®

OA,OB,OCCHIRALCEL®

OF,OG,OK

CHIRALCEL®

CA-1反相

CHIRALPAK®

AD-RH/AD-3R

CHIRALPAK®

AS–RH/AS-3RCHIRALCEL®

OD-RH/OD-3R

CHIRALCEL®

OJ–RH/OJ-3R

CHIRALPAK®

AY–RH/AY-3R

CHIRALCEL®

OZ–RH/OZ-3R其它Chiral-AGP®CROWNPAK®

CR(＋),(－)CHIRALPAK®

OT(＋),OP(＋)CHIRALPAK®

WH,MA(＋)CHIRALPAK

®

QD-AXCHIRALPAK®

QN-AX共价键合型

CHIRALPAK®

IA/IA-3

CHIRALPAK®

IB/IB-3

CHIRALPAK®

IC/IC-3涂布型正相手性柱：手性分析方法的建立和优化分析条件优化流程图(1)酸性中性碱性1.确认流动相中是否使用酸、碱添加剂配制流动相Hex/IPA/TFA=70/30/0.1Hex/IPA/DEA=70/30/0.1Hex/IPA=70/30样品碱性样品添加物在分离中的作用mVMinutes0.01.02.03.04.05.06.07.002468101214161820222410.7413.96Hex/IPA/DEA=90/10/0.1流量：1.0mi/min.温度：25℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ）流动相

Hex/IPA=90/10Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1流动相

Hex/IPA=90/10-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.35mV024681012141618202224262830Minutes10.940.40流量：1.0mi/min.温度：40℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ）05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52Minutes0.00.20.40.60.81.01.21.41.6mV0510152025303540酸性样品（没出峰

)（无法分离

)Column:AY-H(4.6*150mm)Temp:35℃Flow:2.0ML/MINMobilephase:CO2/IPA/DEA=85/15/0.1不同添加剂对手性分离的影响Column:AY-H(4.6*150mm)Temp:35℃Flow:1.2ML/MINMobilephase:CO2/IPA/1-propylamine

=85/15/0.1对于一些特殊的样品：酸碱添加剂同时添加，优化分离Column:OZ-H(4.6*150mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minMobilephase:hexane/IPA/DEA(75/25/0.1)Column:OZ-H(4.6*150mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minMobilephase:hexane/IPA/TFA(85/15/0.1)Column:OZ-H(4.6(150mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minMobilephase:hexane/IPA/TFA/DEA(80/20/O.1/0.05)分析条件优化流程图(2)保留时间?长适宜的分析时间(10-30min.)短增加

异丙醇增加正已烷2.配制好流动相选择合适的手性柱分析筛选结果0510152025303540455055600123456789101112131415Minutes4.684.82OB15mV1234567891011121314Minutes6.716.87OD05101520253035404550556065mV0-505101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52AD05101520253035404550556065mV0123456789101112131415OJmV01020304050607080mV012345678910111213144.7090AS1501020304050607080901000123456789101112131415Minutes4.70OCMinutes1020304050607080mV0123456789101112131415Minutes4.3615OGMinutes001020304050607080mV01234567891011121314Minutes4.36OF色谱条件流动相：

Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1流量 ：1.0ml/min.温度 ：40℃检测波长 ：UV254nm样品 ：选择效果最好的手性柱,然后继续优化分析条件分析条件优化流程图（4-A）部分分离A.降低异丙醇浓度

B.调整温度C.更换醇类4.分析条件继续优化醇浓度的影响05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度Column：AD,Temp.：40℃,Flowrate：1.0ml/min.Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1Hex./IPA/AcOH=100/1/0.1-0.50.00.51.01.52.02.53.03.5mV051015202530354045505560Minutes35.7743.71Sample：Flurbiprofen温度的影响Column：CHIRALPAKADMobilephase：Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1,Flowrate：1.0ml/min.25℃40℃Temp.：

5℃降低柱温可增大α值，但会使峰形变宽升高柱温会减少α值，但会使峰形尖锋-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.00123456789101112131415Minutes8.7212.13α:1.59mVMinutes0510152025303501234567891011121314156.667.52α:1.23mV01234567890123456789101112131415Minutes7.669.12α:1.32Temp.：25℃Rs:1.99Temp.：20℃Rs:2.78Temp.：15℃Rs:3.56温度的影响Column:CROWNPAKCR(+)(4.6*150mm)Mobilephase:PH=1.0高氯酸Flow:0.3ml/minSample:苏氨酸部分分离C.更换醇类B.调整温度4.分析条件继续优化A.降低异丙醇浓度分析条件优化流程图（4-C）由异丙醇换为乙醇---更好的选择性Column:AY-H(4.6X250mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minMobilephase:hexane/IPA/DEA(90/10/O.1)Column:AY-H(4.6X250mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minMobilephase:hexane/EtOH/DEA(90/10/O.1)IA-H80I20DEA0.1-1.0mlmin-35℃IA-M100DEA0.1-1.0mlmin-35℃OZ-H，Hexane/IPA/TFA/DEA=80/20/0.1/0.05（v/v/v)，1.0ml/min

极性模式----意想不到的分离效果OZ-H，MeOH/DEA=100/0.1（v/v)，0.8ml/min

涂敷型（溶剂限制）

正相:正己烷,异丙醇,乙醇反相:水,乙腈,甲醇,乙醇,异丙醇在广泛的流动相条件下具有很强的手性分离能力色谱试验过程中，用于溶解样品的溶剂没有任何限制在各种溶剂中柱性能异常稳定键合型（通用所有溶剂）CHIRALPAK®

IA/IB/ICCHIRALPAK®IA/IB/IC研发背景CHIRALPAK®IA,IB,ICADODNew!键合型固定相的特点流动相组分没有任何限制可以选用任何有机溶剂溶解样品新的手性选择性可以再生，寿命长正相与反相可以在同一支柱子上实现AD-Hvs.IA对于一些化合物，分离度可能优于涂布型分离度优于涂布型实例Column:AD-H(4.6X250mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minMobilephase:hexane/IPA/DEA(90/10/0.1)Column:IA(4.6X150mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minMobilephase:hexane/IPA/DEA(90/10/0.1)AD-Hvs.IA由于在流动相中改善了溶解度，柱效优于涂布型Column:AD-H(4.6X250mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minSolubility:0.5mg/mlMobilephase:hexane/IPA(70/30)Column:IA(4.6X250mm)Temp:35℃Flow:1.0ml/minSolubility:7.0mg/mlMobilephase:MtBE/MeOH(80/20)AD-Hvs.IAOD-Hvs.IB更高的柱效，更好的峰形ChromatographicCondition:Hexane/IPA,90/10(v/v)通过溶剂多样性优化手性分离OD-Hvs.IBIB—含水流动相非水与水相体系通用不同流动相体系下手性分离methaqualone

024681012

50100150200250300=2.81MtBE/EtOH95:5010200.000.010.020.030.040.05n-hexane/CH2Cl275:25=2.36=1.960123456789101112131400.10.20.3toluene/n-hexane/EtOH70:25:5024681012140.00.20.40.60.81.0=1.79n-hexane/CHCl350:50010200.000.010.020.030.04=1.70n-hexane/methylacetate80:2002468101214050100150200250=1.65n-hexane/2-PrOH80:20010200.00.10.2=1.63n-hexane/THF85:15=1.33024681012140.00.20.40.60.81.0n-hexane/acetone85:15CHIRALPAK®IA柱应用实例修复再生后（可使用各种强极性溶剂）柱性能受损（如受强吸附杂质的影响）样品新色谱柱IA,IB,IC柱的修复再生IA,IB,IC柱的修复再生IA柱的修复再生方法：第一：EtOH0.4ml/min30min第二：DMF0.3ml/min3h第三：EtOH0.3ml/min50min第四：H/E=90/10还不行，再用下面条件第一：EtOH0.4ml/min30min第二：THF0.5ml/min2h第三：EtOH0.4ml/min30min第四：DMF0.3ml/min3h第五：EtOH0.3ml/min50min第六：H/E=90/10IA,IB,IC柱的修复再生IBIC柱的修复再生方法：第一：EtOAc1ml/min30min，有添加剂的〉2h,室温保存2天第二：H/I=90/101ml/min1h键合型固定相筛选一般流程选用比较典型的溶剂组合作为起始筛选流动相Hexane/IPA（EtOH）Hexane/THF(DCM,EA)

MtBE/MeOH(IPA,EtOH）

MtBE/THF(DCM,EA)ACN/MeOH(IPA,EtOH）如果分析物的溶解度不好，优先选用溶解度好的有机溶剂作为流动相组分使用多元流动相优化分离多糖反相手性柱：手性分析方法的建立和优化RH系列反相色谱柱参数流动相耐压(MPa)温度范围(℃)pH范围OD-RH水溶液/有机溶剂*1=90/10~0/100105～402～7OJ-RHAS-RH5～40*22～9*2,3AD-RH*1有机溶液：醇（甲醇，乙醇，异丙醇）或乙腈*2pH＞7使用时，温度在5～25℃*3pH超过8时，使用硼酸缓冲液新产品：AY-RH/OZ-RH根据样品性质选择流动相样品性质OD-RH、OJ-RHAD-RH、AS-RH中性水/乙腈酸性磷酸水溶液(pH2)/乙腈0.1M磷酸缓冲液(pH2)/乙腈碱性0.1MKPF6

水溶液/乙腈0.1MNaPF6水溶液/乙腈20mM硼酸缓冲液(pH9)/乙腈20mM磷酸缓冲液(pH8)/乙腈HPLC-MS:流动相条件1）酸性流动相：甲酸、乙酸2）碱性流动相：碳酸氢氨（醋酸铵，甲酸铵）RH反相系列手性筛选一般流程反相流动相的pH值对分离度的影响(AS-RH)中性化合物Benzoin酸性化合物N-CBZ-Norvaline碱性化合物Ofloxacinethylester水溶液水溶液/CH3CN=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3CN=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3CN=80/20流速：0.5ml/min.051015mV02468101214Minutes7.168.77024681012mV012345678910Minutes2.250.01.02.03.04.0mV051015202530354045505560Minutes27.79水磷酸水溶液(pH2)硼酸缓冲液(pH9)051015mV02468101214Minutes7.118.7005101520mV0.02.04.06.08.0Minutes4.174.69020406080mV051015202530354045505560Minutes4.004.484.77051015mV02468101214Minutes6.978.53010203040506070mV012345678910Minutes1.850.02.04.06.08.0051015202530354045505560Minutes30.7436.78有机溶剂种类对分离的影响水/乙腈=50/50水/乙醇=35/65水/甲醇=25/752-Methyl-1-tetralone2-Phenyl-2-butanol手性柱：CHIRALPAKAD-RH、流速：0.5ml/min、温度：25℃反相柱分析条件优化的总结根据样品性质选择流动相※中性，酸性样品对4种反相柱的流动相是一致的。但是，碱性样品对OD-RH、OJ-RH的流动相和AD-RH、AS-RH的流动相是不同的。探索适当的保留时间和流动相组成其它优化条件水溶液和有机溶液比例多数情况下降低有机溶液的浓度能改善分离，但会延长分析时间。色谱柱温度降低柱温能增加α值，但会使峰形变宽。有机溶剂的种类有机溶剂的种类不同，其洗脱强度也不同。有时其分离效果也发生一些变化手性分析方法开发：高通量、快速筛选手性色谱柱组合筛选手性色谱柱组合CHIRALPAK®AD-HCHIRALPAK®AS-HCHIRALCEL®OD-HCHIRALCEL®OJ-HCHIRALPAK

®

AY-HCHIRALCEL

®

OZ-HCHIRALPAK

®

IA

CHIRALPAK

®

IBCHIRALPAK

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IC手性色谱柱尺寸：

0.46cmI.D.×15cmL组合筛选设备ｴﾀﾉｰﾙIPAﾍｷｻﾝ泵紫外检测器色谱柱自动切换阀流动相2自动进样器组合筛选设备示意图流动相1溶剂切换阀旋光检测器串联旋光检测器的好处11.用UV检测器只出现“１峰”的时候

→应用旋光检测器可确认其分离状况2.可确认洗脱顺序串联旋光检测器的好处2若筛选没得到理想的分析条件时调整流动相中醇的比例更换流动相种类调整流速调整温度尝试其他的色谱柱手性色谱柱使用：注意事项与疑难解析D