朊病毒及其检测

（优选）朊病毒及其检测现在是1页\一共有40页\编辑于星期六CONTENTS一、前言二、PrPC与PrPSC三、PrPC的功能四、朊病毒的致病机理五、朊病毒的检测六、问题与展望现在是2页\一共有40页\编辑于星期六一、前言现在是3页\一共有40页\编辑于星期六1引言

传染性海绵状脑病(transmissiblespongi-formencephalopathy,TSE)是一类致死性的神经系统退行性疾病。在哺乳动物中常见疯牛病、羊瘙痒症、猫海绵状脑病以及传染性水貂脑软化病等；在人身上则发现了库鲁病、致死性家族失眠症、克-雅氏病以及格斯特曼综合症等。患病的人和动物，大脑皮层的神经元细胞会发生进行性空泡化,星形胶质细胞不断增生,造成灰质变薄而白质相对明显,最后变成海绵状态。现在是4页\一共有40页\编辑于星期六（左）病羊神经组织的海绵状损伤。（右）病人大脑组织切片，海绵状病变及周围的沉淀斑现在是5页\一共有40页\编辑于星期六2朊病毒的发现200多年前英国的牧人就注意到羊的一种致死性疾病。

20世纪初M.fadyian提出该病是由寄生虫引起的。1936年Cuille等发现瘙痒因子有传染性，用滤膜过滤后仍具有传染性，而提出该因子是一种病毒。1966年Gajdusek证实了CJD的传染性，并根Scrapie、Kuru、CJD3种疾病的共同特征提出了传染性海绵状脑病(TSE)这一概念。1882美国生物化学家Prusiner证明并提出羊瘙痒病的病原体是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，称为蛋白质侵染因子(proteinaceousinfectiousparticle，简称prion)。现在是6页\一共有40页\编辑于星期六3朊病毒引起的人类疾病现在是7页\一共有40页\编辑于星期六4朊病毒引起的人类疾病

现在是8页\一共有40页\编辑于星期六5疾病来源人类prion病约有15%的患者具有遗传性，即为家族性疾病，为常染色体显性遗传，因编码PrP的基因突变所致。遗传性由食用疯牛病病牛及其他染病动物所致。食源性传播目前已报道全世界因医源性传染而引起的prion病已达160多例，而且，输血及血制品是否也能传播此病，已引起人们的关注。医源性感染现在是9页\一共有40页\编辑于星期六6致病特点2一旦发病，呈慢性、进行性发展，以死亡告终；5患者以痴呆、共济失调、震颤等为主要临床表现。4无抗原性，不能诱导产生特异性免疫应答；1潜伏期长，可达数月至数年甚至数十年；3病理学特征是大脑皮质神经元空泡变性、死亡、缺失，而星形胶质细胞高度增生，故大脑皮质疏松呈海绵状：有淀粉样斑块形成，HE染色淡红脑组织中无炎症反应：无淋巴细胞和炎症细胞浸润；现在是10页\一共有40页\编辑于星期六二、PrPC与PrPSC现在是11页\一共有40页\编辑于星期六结构

转化理化性质PrPC与PrPSC现在是12页\一共有40页\编辑于星期六朊病毒蛋白(PrionProtein)，简称为PrP。PrPC是指一般情况下，正常宿主细胞基因编码产生的朊蛋白，无致病性，是一种糖基磷脂酞肌醇(CPI)修饰膜在糖蛋自。广泛表达于脊椎动物，它与神经系统功能的维持、淋巴细胞信号转导、核酸代谢等有关。PrPC当其发生构象改变后可变成致病性朊病毒(PrPsc)，PrPsc可引起包括疯牛病在内的一系列致死性神经性疾病。相对分子质量为27～30KD，故又称作PrP27～30。PrPSC1PrPC与PrPSC现在是13页\一共有40页\编辑于星期六PrPc

PrPScα螺旋β折叠

二者是异构体,由同一染色体基因PRNP编码，其氨基酸序列完全一致,根本差别在于它们构象上的差异，PrPC分子中含42%的α螺旋，β折叠仅为3%，而PrPSC的β折叠高达43%，α螺旋为30%。故一般认为，PrPSC是由于PrPC发生蛋白质错误折叠，一些α螺旋变构为β折叠，三维构象发生变化而产生的，同时带来一系列理化性质的变化。2PrPC与PrPSC的结构现在是14页\一共有40页\编辑于星期六3PrPC与PrPSC的理化性质现在是15页\一共有40页\编辑于星期六4PrPC向PrPSC的转化现在是16页\一共有40页\编辑于星期六（PrPSc的累积）（PrP转化为PrPSc)(PrP与PrPSc之间反应)（PrPc内生）模型一：该模型是假定一个单一的PrPSC分子与一个单一的PrPC分子结合并催化其转化成PrPSC。这两个PrPSC分子,可以继续转换成PrPC。现在是17页\一共有40页\编辑于星期六(伸长)（构象变化)(破碎成多个部分)（感染）模型二：假设PrPSC只是纤维，捆绑PrPCfibril，然后将其转化成PrPSC，形成更长的纤维，这一现象可在染病毒致病中观察到。现在是18页\一共有40页\编辑于星期六三、PrPC的功能现在是19页\一共有40页\编辑于星期六核酸代谢抗氧化参与神经系统Cu2+代谢维持神经系统功能信号转导细胞调亡PrPC的功能现在是20页\一共有40页\编辑于星期六1维持神经系统功能

在所有细胞类型中,以神经元表达PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突触处(终板处也有富集)，这提示PrPC对神经系统有特殊的重要性。PrPC除实验表明，PrPC缺失虽不引起肉眼可见的行为和发育障碍，但在整体动物水平来看可导致与昼夜节律有关的行为异常。在神经系统水平，PrPC缺失可导致电生理参数方面的改变。现在是21页\一共有40页\编辑于星期六有证据表明，在出现进行性运动失调症状PrPC缺失小鼠中，发现脑部严重萎缩，蒲肯野细胞异常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野细胞过度兴奋而导致小鼠死亡。PrPC缺陷鼠还表现出对外源性铜和过氧化氢等应激诱导剂应答方面的改变。在细胞水平，PrPC缺陷鼠的神经元在培养时存活能力下降，且对铜和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所导致的氧化损伤和毒性的敏感性增加；星形胶质细胞在摄取谷氨酸方面有异常；小胶质细胞对兴奋物质的反应性下降；在突触形成中有结构改变。由此可见，PrPC可能在一定程度上参与神经系统功能的维持。现在是22页\一共有40页\编辑于星期六2参与神经组织的Cu2+代谢

PrPC作为脑组织中膜在铜结合蛋自参与神经组织中Cu2+的稳态平衡调节，当转变为PrPSC就失去结合Cu2+的能力，造成神经组织中Cu2+含量异常，导致神经细胞损伤。

Cu2+对不同神经细胞PrPC的影响也不相同。现在是23页\一共有40页\编辑于星期六3抗氧化

PrPC通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性。PrPC借其八肽重复区最多可结合4个铜原子。结合后形成的复合物具有抗氧化活性，从而保护细胞免受氧化损伤。现在是24页\一共有40页\编辑于星期六4参与淋巴细胞信号转导

PrPC可高水平地在人T、B淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞中表达，不同细胞中表达PrPC的糖基组成、糖链形状及蛋自酶解的敏感性都有差异。

T细胞的活化伴随着其表而PrPC的表达上调，且PrPC在记忆T细胞比初始T细胞的表达水平高。现在是25页\一共有40页\编辑于星期六5细胞凋亡

在PrP敲除小鼠神经元中，多种凋亡相关蛋自显著增加，线粒体Ca2+含量改变、细胞色素c释放，都表明PrP参与细胞凋亡调控过程。

体外试验也显示PrPC能够保护人的神经元免受Bax诱导的细胞凋亡，而缺失八肽序列或C端带有突变的PrP均不具有该活性。现在是26页\一共有40页\编辑于星期六6核酸代谢

Gabus等根据小鼠中瘟痒病的感染过程会因鼠自血病病毒（MuLV）的复制而加速，以及人类PrP功能上类似于NCp7，可辅助反转录酶合成前病毒DNA等现象，提出PrP可能参与了体内核酸代谢过程。现在是27页\一共有40页\编辑于星期六四、朊病毒的致病机理现在是28页\一共有40页\编辑于星期六致病机理电泳活性染色法阮病毒学说

“yeastprions”学说

现在是29页\一共有40页\编辑于星期六1阮病毒学说

PrPC是一种膜蛋白，其C端含有23个氨基酸组糖基磷酸肌醇(GPI)锚受体结合位点，因此可通过糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitolphosphohptds)联在膜上，定位于细胞膜的穴样内陷类结构域（CLDs），在神经元，当膜浆膜上的PrPC变成为PrPSC后，PrPSC脱落并聚集在神经元的溶酶体。当达到数量，就可使神经元细胞破裂，形成神经组织的空泡化，并使星型胶质细胞增生，现在是30页\一共有40页\编辑于星期六现在是31页\一共有40页\编辑于星期六2“yeastprions”学说

现在是32页\一共有40页\编辑于星期六3蛋白的氧化反应学说杨池明提出了疯牛病蛋白长寿命自由基即为疯牛病中的亚病毒的理论设想，他认为真正的疯牛病蛋白亚病毒可能是由蛋白的氧化反应所形成的疯牛病蛋白自由基。

应用此理论能够解释疯牛病的一些病理现象。现在是33页\一共有40页\编辑于星期六五、朊病毒的检测现在是34页\一共有40页\编辑于星期六接种传递组织印记法酶联免疫吸附法毛细管凝胶电泳朊病毒的检测现在是35页\一共有40页\编辑于星期六取组织标本

10倍连续稀释研磨10个稀释浓度分别接种小鼠直到死亡或盲传几代出现症状杀死，取脑组织检查死亡不出现症状观察饲养24h未死亡正常饲养补接1动物的接种传递实验现在是36页\一共有40页\编辑于星期六取标本甲酚脱毒甲醛固定石蜡包埋

55℃干燥二甲苯脱蜡

异丙醇水化

空气干燥蛋白酶K消化

盐酸胍处理

1.前处理2.检测NC：硝酸纤维素膜

前处理品免疫学检测取出NC膜5-7μm薄片收集在NC上2mm厚切片切片55℃水浴2组织印记法现在是37页\一共有40页\编辑于星期六匀浆离心处理显色最后酶标仪读板将脑组织置于8%的Zwittergent3-12和0.5%十二烷基肌氨酸钠中

加入特异性一抗加入酶标二抗最后加入底物用胶原酶、DNaseI（脱氧核糖核酸酶I），蛋白酶K处理

收集富含PrPsc沉淀，将所得沉淀溶于3-4mol/L硫氰酸胍，包被酶标版

3酶联免疫吸附法现在是38页\一共有40页\编辑于星期六人工合成