酶免检测技术原理与影响

3月18日免疫室差错问题分析及整改措施3月18日免疫室出现了标本漏检问题，导致病人情绪不满，甚至大吵大闹，给科室形象造成了一定的影响。暴露出了免疫室一些问题，如严格按检测流程执行力度问题，认真细心问题等，同时也违背了免疫室规定的检验报告结果时效性原则和以病人为中心的服务宗旨。针对上述事件，经免疫室人员讨论、分析，制定出以下整改措施：1、端正态度、要认真、负责2、严格执行免疫室检验流程，仔细核对标本，不同批次检测标本标记清楚3、增加人员缓解紧张工作状态4、欢迎大家给出宝贵建议5、坚持免疫室两个原则第一页，共38页。免疫室简介检验项目普免术前四项（普免）术前四项（急筛复查）体检AFPCEA体检HAV(IgM)HEV(IgM、IgG)HBcAbTAP化学发光肿瘤性激素HCG贫血三项胰岛素C-肽自身免疫自免肝四项ENA谱抗核抗体抗线粒体抗体血管炎过敏原呼吸道HIV初筛实验室迎检任务前景展望检测方面：免疫球蛋白、补体、免疫细胞、细胞因子、免疫移植等，技术方面：电泳技术、细胞技术、分子生物学技术、流式细胞技等教学方面：华信临床检验技术专业第二页，共38页。免疫室简介

工作人员姓名职称职务职责状态孙文鲜主管检验技师常规免疫免疫室组长固定人员刘丽娜主管检验技师发光免疫免疫室质控管理员固定人员史可检验师自身免疫免疫室生物安全及感染控制管理员固定人员冯凡检验员常规免疫免疫室仪器维护及信息管理员固定人员夜班人员科室骨干科室骨干科室骨干暂时固定坚持两个原则：1、坚持检验结果的准确性、及时性、有效性2、坚持以病人为中心，全心全心全意服务病人第三页，共38页。免疫室简介免疫室日常工作量（3月23日为例）项目标本量（人份）项目包括内容备注普筛88门诊、病房普筛，乙肝五项（酶免法）急筛复查47所有急筛（酶免法）发光51肿瘤、性激素、贫血三项、胰岛素、C-肽、HCG体检37AFP、CEA、乙肝五项、丙肝、普筛自免3自身免疫、呼吸道、过敏原、杂项9TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、HBcAb-IgM总计234第四页，共38页。免疫室简介免疫室特殊项目检测成本项目成本（％）项目成本（％）项目成本（％）项目成本（％）备注AFP66.29FSH66.29Ferr52.51呼吸道63.98CEA66.29LH66.29Foll89.97过敏原69.63CA15374.76P66.29B1290.05抗核抗体66.60CA19985.59T66.29胰岛素67.94抗ds-DNA158.20CA12585.59PRL66.29C-肽62.20抗平滑肌抗体69.69FPSA85.59E266.29自免肝55.02ENA谱57.50TPSA85.59HCG66.29血管炎61.70抗线粒体抗体待定注：此统计结果可信度为95％第五页，共38页。一、抗原抗体反应二、酶免疫技术的分类、原理及特点三、酶联免疫吸附试验四、ELISA法检测注意事项五、ELISA法检测常见问题及解决方法第六页，共38页。一、抗原抗体反应第七页，共38页。抗原抗体反应原理抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。第八页，共38页。抗原抗体反应原理氢键结合力范德华引力静电引力疏水作用力抗原抗体结合力第九页，共38页。抗原抗体反应特点及影响因素抗原抗体反应特点：1、特异性2、比例性

3、可逆性抗原抗体反应影响因素：1、反应物自身因素：抗原抗体2、反应环境条件：电解质酸碱度温度抗原抗体反应影响因素：1、反应物自身因素：抗原理化性状、表位种类、数目抗体来源、特异性、亲和性、效价2、反应环境条件：电解质8·5g/LNaCl溶液

酸碱度pH6--9为宜温度最适温度为37℃第十页，共38页。二、酶免疫技术的分类、特点及原理第十一页，共38页。1、酶免技术的分类.酶免疫技术酶免疫组化组织切片或其它标本中抗原的定位

酶免疫测定液体标本中抗原或抗体的定性和定量均相

异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定1、酶放大免疫测定技术EMIT2、克隆酶供体免疫分析CEDIA分离结合、游离酶标记物，底物测定检测微量短肽激素、小分子抗原最广泛，酶联免疫吸附试验小分子激素、半抗原测定第十二页，共38页。

酶免技术的分类2、酶免技术特点抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性主要试剂:

酶标记的抗体或抗原酶标物特点：

免疫学活性酶对底物的催化活性第十三页，共38页。3、酶免技术原理及特点原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。第十四页，共38页。二、酶联免疫吸附试验第十五页，共38页。1、基本原理.原理包被12反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体3洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离4底物显色定性或定量的分析三个必要试剂

固相的抗原或抗体

酶标记物（酶结合物）

酶反应的底物

第十六页，共38页。.双抗体夹心法（测抗原）方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定

HBsAg、HBeAg、甲胎蛋白、HCG等.2、方法类型及反应原理第十七页，共38页。方法类型及反应原理双位点一步法（测抗原）方法：用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原酶标抗原同时加入，加底物显色应用：与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏度，需注意“钩状效应”第十八页，共38页。竞争法（测抗原）

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）方法类型及反应原理第十九页，共38页。.双抗原夹心法（测抗体）原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体方法类型及反应原理第二十页，共38页。方法类型及反应原理间接法（测抗体）方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定第二十一页，共38页。方法类型及反应原理竞争法（测抗体）原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测第二十二页，共38页。方法类型及反应原理捕获法（测抗体）

应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体第二十三页，共38页。四、ELISA法检测注意事项第二十四页，共38页。1、标本避免溶血、高脂血、纤维蛋白凝块尽量新鲜，避免细菌污染一般5天内检测的血清可4℃保存，否则低温保存。

第二十五页，共38页。

2、试剂.试剂盒保存于2-8℃.使用前应先将检测试剂盒放置室温平衡15-30分钟，保证酶等液体的初始反应温度及活性剂的溶解。.观察外包装和内组份有无漏液。第二十六页，共38页。

3、加样

A.加样不可太快；B.要避免加在孔壁上部；C.不可溅出；D.避免产生气泡；E.尽可能使用同一加样器，装紧枪头，加样后充分混匀。加样器定期校准！第二十七页，共38页。温育温度的选择足够的反应时间“边缘效应”的排除4、温育第二十八页，共38页。5、洗板

按说明书洗板次数防止洗板机堵孔有适当的侵泡时间每孔加入洗液>350ul

不溢孔，残留<5ul洗板后拍干，封板纸

不能重复使用

第二十九页，共38页。

6、显色检查底物溶液的有效性；试剂显色时先加A液，后加B液，二者不要颠倒。前后加入的间隔时间不超过10分钟，不漏加。A、B液应避免接触污染物。不同厂家、批次酶显色液不得混用第三十页，共38页。

7、终止和读数肉眼判断不准确，影响结果酶标仪的波长选择的问题。加完终止液后30分钟内读取数据。保证酶标板的底部是清洁干燥的。酶标仪临界值计算公式的设定第三十一页，共38页。8、结果判读

项目CUTOFF阳性判断HIV（科华）0.1×MIN（PCx，2.5)>cutHIV（丽珠）0.15+MAX(NCx,0.08)>cut灰区又称灰色带反应。就是把OD值在Cutoff值正负20%这个范围内的标本称为灰区标本。这个范围称为灰区。.灰区是客观存在的，没有不存在灰区的试剂，我们只是尽量减少灰区的出现比例。.减少灰区最有效的方法就是尽量将板洗涤干净。不同试剂盒，CUTOFF值计算方法不同例：第三十二页，共38页。五、ELISA法检测常见问题及解决方法第三十三页，共38页。ELISA实验常见问题及解决方法类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgGFc段非特异结合，因此可能与包被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低异嗜性抗体：人血清中含有抗齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP显色。细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。标本4℃存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议<1周标本凝固不全：残留纤维蛋白原形成的纤维蛋白块，造成假阳性。内源性标本因素：外源性标本因素：第三十四页，共38页。现象可能原因解决方法显色淡灵敏度低1、试剂盒未平衡至室温实验前试剂盒置于室温平衡30分钟以上2、水浴箱温度不到37℃调整水浴箱温度至37℃孵育期间不宜多开门3、孵育时间不够校准定时钟、准确定时4、样品加样量偏少校准吸液器吸嘴与移液器接合紧密吸嘴一次性使用5、酶结合物加样量偏少瓶身应垂直滴加，保证液滴最大6、底物作用时间不够延长至标准时间7、样品用叠氮钠防腐，抑制了酶活性与酶一同加入的样品中不能用NaN3防腐8、蒸馏水被污染换用合格蒸馏水或去离子水9、洗涤液配置不当，稀释倍数>1:20准确配置洗涤液10、试剂盒运输时间太长，受高温影响夏天长途运输时，缩短时间，低温措施11、试剂盒失效不适用失效试剂第三十五页，共38页。现象可能原因解决方法重复性差1、样品数量较多、加样时间过长重复测定标本时，尽可能使用同一移液器，装紧吸嘴，条件、人员应尽量与上次保持一致，以排除这些因素造成的重复性差的可能性。2、加样量不一致3、孵育时间不一致4、洗涤条件不同5、操作人员不同满板白，阳性对照不显色1、把终止液误当作酶结合物、或底物使用严格按试剂说明书操作，加液时看准标签，正确稀释洗涤液，不要漏加试剂2、漏加试剂，如酶结合物、底物A、B液3、蒸馏水被污染，或盛洗涤液桶被污染，留有使酶失活的物质，换用合格水盛蒸馏水的瓶子要洁净第三十六页，共38页。现象可能原因解决方法满板显色