细胞融合的方法过程和影响因素详解演示文稿

细胞融合的方法过程和影响因素详解演示文稿现在是1页\一共有41页\编辑于星期日（优选）细胞融合的方法过程和影响因素现在是2页\一共有41页\编辑于星期日细胞融合（cellfusion）：又称somatichybridizationorcellhybridization，指在自然条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性方式融合形成一个杂合细胞的过程。

它能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体定位、改良动物遗传特性及创造新的符合人类需要的新的细胞系极为有效的手段。自发融合：受精过程，成肌细胞融合，巨噬细胞融合，体外培养系统中的细胞融合诱发融合一、细胞融合的概念现在是3页\一共有41页\编辑于星期日1962年Okata发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体，开创动物细胞融合的暂新领域。现在是4页\一共有41页\编辑于星期日

SingerandNicolson’sModelofmembranestructure:Thefluid-mosaicmodelisthe“centraldogma”ofmembranebiology.Thecorelipidbilayerexistsinafluidstate,capableofdynamicmovement.Membraneproteinsformamosaicofparticlespenetratingthelipidtovaryingdegrees.TheFluidMosaicModel,proposedin1972bySingerandNicolson,hadtwokeyfeatures,bothimpliedinitsname.现在是5页\一共有41页\编辑于星期日ThechemicalcompositionofmembranesA.MembraneLipids:TheFluidPartoftheModelPhospholipids:Phosphoglyceride磷酸甘油酯andsphingolipidsGlycolipids

Sterols(isonlyfoundinanimals)Membranelipidsareamphipathic.Therearethreemajorclassesoflipids:现在是6页\一共有41页\编辑于星期日AnOverviewofmembranefunctions

1.Definetheboundariesofthecellanditsorganelles.2.Svidemechanismsforcell-to-cellcontact,communicationandadhesion现在是7页\一共有41页\编辑于星期日细胞融合机理

细胞融合的关键：脂双层的接触靠近,细胞桥形成,胞质渗透－细胞核融合。胆固醇磷脂糖脂寡糖疏水a螺旋鳌合蛋白极性孔蛋白分子Hydrophobic疏水的Hydrophilic亲水的现在是8页\一共有41页\编辑于星期日二、诱发细胞融合的方法病毒化学－PEG电融合现在是9页\一共有41页\编辑于星期日1.病毒促进细胞融合

病毒类融合剂是研究的最早的促融剂，一些致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能诱导细胞融合，但由于毒性大，应用上收到很大限制。仙台病毒（HVJ）是一类被膜病毒，诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA，而是它的外膜。这一现象对你有何启示？现在是10页\一共有41页\编辑于星期日HVJ促融机制：当病毒位于两个细胞间时，病毒表面spike上神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部聚集在病毒周围，在高pH和Ca2+条件下局部细胞膜发生融合。现在是11页\一共有41页\编辑于星期日2.化学融合剂促进细胞融合

1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethyleneglycol,PEG)可促进细胞融合，Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。PEG是一种多聚化合物，商品名卡波蜡Carbowax,分子量200－20000，靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷，目前已衍生达50多种。现在是12页\一共有41页\编辑于星期日聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合

原理：PEG带有大量的负电荷,和细胞膜表面的负电荷在Ca2＋的连接下，形成静电键，促使异源的细胞膜间的粘着和结合，在高pH,高Ca2＋溶液的作用下，将Ca2＋和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种细胞膜上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。现在是13页\一共有41页\编辑于星期日现在是14页\一共有41页\编辑于星期日现在是15页\一共有41页\编辑于星期日注意事项1PEG融合的关键是作用时间2PEG规格和纯度与融合效率有关3融合与细胞密度有关4融合液中加入少量CaCl2，即维持一定电导率，对细胞也有保护作用现在是16页\一共有41页\编辑于星期日3.电融合技术（Electroporation）

现在是17页\一共有41页\编辑于星期日现在是18页\一共有41页\编辑于星期日现在是19页\一共有41页\编辑于星期日3现在是20页\一共有41页\编辑于星期日注意事项1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。现在是21页\一共有41页\编辑于星期日融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。现在是22页\一共有41页\编辑于星期日优点：融合率高，达70％－80％，甚至100％融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞现在是23页\一共有41页\编辑于星期日

原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。

1）亲本

2）同核体homokaryon：同源细胞融合体，它们的基因型和表现型完全一样。

3）异核体heterokaryon：异源细胞的融合体，它们含有双亲细胞核和细胞质物质。

4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体

5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。

6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体第二节融合细胞的筛选现在是24页\一共有41页\编辑于星期日动物细胞融合的筛选方式：1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长现在是25页\一共有41页\编辑于星期日2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。现在是26页\一共有41页\编辑于星期日3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长。现在是27页\一共有41页\编辑于星期日4具有所需性状杂种细胞的筛选现在是28页\一共有41页\编辑于星期日HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（Aminopterin，A）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种:需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:（催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸）次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶:（催化次黄嘌呤产生肌苷）主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻断FH2到FH4合成。现在是29页\一共有41页\编辑于星期日杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤A培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。现在是30页\一共有41页\编辑于星期日基于HAT培养基的筛选系统H（Hypoxanthine次黄嘌呤）应急途径中所提供之外源核苷酸前体A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成T（Thymidine，胸腺嘧啶）应急途径中所提供之外源核苷酸前体HGPRT酶缺陷型细胞株（长期培养系）不能在HAT培养液中生长正常细胞体外生存能力有限，最终也将死亡融合细胞最后，只有融合细胞在HAT培养液中存活现在是31页\一共有41页\编辑于星期日第三节融合细胞克隆化利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。现在是32页\一共有41页\编辑于星期日通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1）取出阳性孔内的细胞进行计数2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，每孔内将为一个细胞4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。有限稀释法现在是33页\一共有41页\编辑于星期日在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。软琼脂培养法现在是34页\一共有41页\编辑于星期日第四节杂种细胞在细胞生物学研究中的应用1）基因定位

不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即染色体分离的现象。由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上。例如：HGPRT－人细胞与TK－的小鼠细胞融合后，可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色体的杂种细胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E组染色体上的。现在是35页\一共有41页\编辑于星期日2）体细胞杂种的致瘤性分析通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。3）遗传缺陷的基因互补基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷