微生物分子生态学研究方法

分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学。它是生态学与分子生物学相互渗透的形成的一门新兴交叉学科，其研究内容包括种群在分子水平的遗传多样性及遗传结构，生物器官变异的分子机制，生物体内有机大分子对环境因子变化的响应，生物大分子结构、功能演变与环境长期变化的关系以及其他生命层次生态现象的分子机理等。第一页，共59页。微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。群落结构决定了生态功能的特性和强弱。群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。群落结构变化是标记环境变化的重要方面。通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。第二页，共59页。20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。微生物群落结构和多样性研究方法：在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。第三页，共59页。虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用。采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少（不到1%）。Amann等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）。

不能全面地反映微生物区系组成状况，烦琐、耗时。1、传统的微生物培养法第四页，共59页。微生物不可培养的原因

培养条件

营养限制

失去生态位

第五页，共59页。2、群落水平生理学指纹方法(CLPP)微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)，通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性的分析方法。具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。第六页，共59页。BIOLOG鉴定系统自动化、快速可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。每个孔中含有不同的底物菌悬液或无菌水仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据库还不完善在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种）利用情况。干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无色还原成紫色。第七页，共59页。3、生物标记物法（Biomakers）生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适的仪器加以定量测定。优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离，能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有一定的客观性。第八页，共59页。醌指纹法(QuinonesProfiling)呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q)和甲基萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一步区分。每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。醌指纹法具有简单快速的特点。第九页，共59页。磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid,PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fattyacidmethylester,FAME）谱图分析脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析出全细胞的FAME谱图。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。第十页，共59页。

PLFA方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化,能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂肪酸,但是也有其局限性。第一,他不能从种的水品上鉴定微生物,只能鉴定到属;第二,这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸,标记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计,因此操作过程需要十分谨慎,防止人为因素的干扰。第三,细菌和真菌在不同的生长时期以及环境压力下的脂肪酸含量有所变化,给监测带来困难。另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。第十一页，共59页。4.ERIC(肠杆菌基因间保守重复序列)-PCR指纹图谱技术第十二页，共59页。第十三页，共59页。第十四页，共59页。DiGiovanni等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。在微生物群落中，各细菌数量占1-10%时，其特征性ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERIC-PCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的多少，条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。分析不同环境样品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指纹图谱的差异，就可比较不同生态系统微生物群落的差异，或者同一个群落在不同功能状态下的结构变化。第十五页，共59页。E1:5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3'E2:5'-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3'ERIC-PCR引物20pmol/μl第十六页，共59页。第十七页，共59页。5.以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重复序列和随机基因组序列等。最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要指标。第十八页，共59页。Diversityestimationbasedonmolecularmarkers第十九页，共59页。实验原理16SrDNA是基因组的“biomarker”–核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16SrDNA广泛存在于所有原核生物的基因组中。–16SrDNA的序列中包括保守区和可变区。–序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。–GeneBank和RDPⅡ（RibosomalDatabaseProject）数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释的16SrDNA序列，可供进行比对。第二十页，共59页。16SribosomalRNAPresentinalllifemolecularchronometertaxonomy(largedatabase)evolutiononeactivebacterialcell:~104copies~15rRNAgenes(i.e.,rDNA)(Mycobacteriumtuberculosis,Mycoplasmapneumoniae,

Sulfolobussolfataricuswith1copy,Clostridiumparadoxum

with15copies)~1500nt(enoughinformation)fourdifferentdomainsconservedregions(novariationamongalllife)variableregions(V1-V9)Source:Louis,B.,GeneIV,1997第二十一页，共59页。环境16SrDNA文库的构建与组成分析技术第二十二页，共59页。1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性。16SrDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致；发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群；与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性；这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。第二十三页，共59页。构建环境16SrDNA文库的方法用环境基因组总DNA进行16SrDNAPCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16SrDNA扩增并收集到一起。universalprimers:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Esherichiacolibases8to27)和5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(E.colibases1507to1492)“TA克隆”：把每一个16SrDNA分子放到文库中的每一个克隆里。第二十四页，共59页。第二十五页，共59页。第二十六页，共59页。阳性克隆筛选的过程：1.Amp抗性，挑选出含有质粒的克隆2.蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆3.PCR筛选，挑出带有正确长度插入片段的克隆第二十七页，共59页。ARDRA分型与测序第二十八页，共59页。变性梯度凝胶电泳（DGGE）变性梯度凝胶电泳（Denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。第二十九页，共59页。原理双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain,MD)和解链行为(meltingbehavior)。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区域依次发生解链。第三十页，共59页。显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA片段共有3个解链区域。MD1是解链温度最低的一个解链区域，MD3是温度最高的一个解链区域。第三十一页，共59页。不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。一旦DNA片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，不同的DNA片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。第三十二页，共59页。然而，当变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。第三十三页，共59页。第三十四页，共59页。当用DGGE/TGGE技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerasechainreaction）扩增技术，用PCR扩增的16SrDNA产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16SrRNA基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析500bp以下的DNA片断，所以一般选择扩增16SrRNA基因的V3区或V6-V8区。第三十五页，共59页。40%60%DenaturantCABCBADenaturingGradientGelElectrophoresisPCR11f1512r1392r968fgc16SrDNA第三十六页，共59页。第三十七页，共59页。第三十八页，共59页。

环境样品的核酸提取在土壤微生物生态中非常重要。最初采用的方法主要是剧烈的机械打碎以及超声波破碎细胞。但是这种方法得到的DNA片断一般在5K~10K大小,不适合作微生物的群落分析。微生物细胞与环境中的土壤颗粒、粘土以及有机物接合紧密,这对高效率提取核酸造成了很大的困难。同时,腐植酸对DNA的检测和定量也有很大的影响,主要表现在抑制DNA高温聚合酶的活性,干扰限制酶的位点识别,降低转化效率以及DNA杂交的特异性。JizhongZhou等人研究了各种提取方法,他们将土壤样品DNA提取分为细胞裂解粗提DNA和纯化两个步骤,并将几种方法进行比较,建立了一种对大多数土壤样品简单、快速、高效的基于SDS的提取方法。很多实验表明,现在能够从土壤样品中提取出超过90%的rDNA第三十九页，共59页。基于PCR技术的方法也存在着不足:①环境样品在提取核酸前的厌氧或室温存放不可避免的导致其样品中微生物的变化,冷冻可以减缓变化,但是不能存放时间过长,真菌在0~4摄氏度仍可以观察到明显的生长现象。②每次提取DNA的效率不同,造成结果重复性差。③某些原核生物细胞比其他细胞容易裂解,引起裂解程度不均一,使得不易裂解的细胞的丰度估计过低。④引物对不同样品的扩增效率不同,引起丰度估计偏差。⑤理论上,对真核生物的分析应该象原核生物一样进行,但是由于真核生物的核糖体的编码基因以及调节机制比较复杂,对其的研究还不够透彻,现今应用在真核微生物生态学的分析上还是比较少。第四十页，共59页。荧光技术

第四十一页，共59页。（二）GFP基因1、绿色荧光蛋白的来源荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物（绿色荧光）和几乎所有栉水母类的动物（蓝色荧光）在受到刺激时都可以发出荧光。1962年，Shimomura和Johnson等人首先从水螅水母类动物AequoreaVictoria中分离、纯化出一种荧光物质，称为绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProteins，GFPs)。目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Renilla)的荧光蛋白，即AequoreaGFP和RenillaGFP(A-GFP和R-GFP）。第四十二页，共59页。2、GFP的特性：A-GFP是球状的蛋白质，分子量为27-30KDa的单体，最高吸收峰为395nm，肩峰为473nm，发射光谱是λmax=508-509nm。生色团的形成首先是Gly67的氨基对Ser65的羰基亲核进攻而环化成五元环，同时失去一分子水形成咪唑基。在有氧条件下，新的N=C双键促进Tyr66的α、β-氧化脱氢，从而形成一个连续的π电子芳香族系统-生色团。第四十三页，共59页。GFP生色团形成示意图(3和4表示不同pH条件下的两种形式,4和5是同分异构体)成生色团。第四十四页，共59页。3荧光特性首先，仅以蓝光或紫外光照射GFP就能激发其荧光，并不需要外加任何底物或共作用因子；荧光稳定，不易衰退，只有在过热(>65℃)、过酸(pH<4)、过碱(pH12-13)或其它变性剂(如6M胍基盐酸)存在的条件下GFP才会变性，荧光消失。当变性条件去除后，49%-90%以上的蛋白质能够很快复性。更重要的是，它们在很大的pH范围内(pH7-12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。GFP基因的表达并没有物种、细胞种类、位置的限制，而且GFP不论在真核细胞还是原核细胞中表达后，在蓝光照射下都能产生强烈荧光。第四十五页，共59页。4、绿色荧光蛋白的优缺点GFP是迄今为止唯一一种活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。（1）GFP的优点：检测方便：因为GFP荧光反应不需要外加底物、酶或其它共反应因子，GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到，不会损伤正在生长的细胞和组织。荧光稳定：GFP对光致漂白作用有强烈的耐受性，能耐受长时间光照，从而延长了可探测时间。无毒害：GFP对生活细胞基本无毒害。共用性和通用性：GFP的表达几乎没有受体范围的限制，在原核和真核生物中都获得了成功的表达，是一种在生物界较为“通用”的基因。其次，因为GFP较小，只含有238个氨基酸，编码GFP的基因序列也较短，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。第四十六页，共59页。（2）GFP的缺点：正因为其荧光反应不是酶反应，所以GFP的检测不是很灵敏，而且不易对其荧光进行定量测定。GFP基因的表达可能有假象存在：细胞本身存在一些可以受光激发的物质，能产生一定量荧光。第四十七页，共59页。GFP标记降解菌的生态学研究第四十八页，共59页。荧光标记蛋白的应用许多微生物在环境变化过程中表现出一种“存活但不能被培养”(viablebutnonculturable,VBNC)的状态。在这种状态下,细胞不能在传统的培养基上生长,但仍然处于存活状态,并在一定条件下可以恢复代谢活性并转入可培养的状态。M.Lowder等人他们用绿色荧光蛋白(GFP)的一种短半衰期突变株作为新陈代谢的指示,对这种状态的微生物进行了研究。这种不稳定的蛋白不同于一般的GFP,在“饥饿”或者VBNC状态下很快失去荧光。这样,就可以用GFP作为指示剂监测由于环境变化而引起微生物新陈代谢的变化.第四十九页，共59页。荧光染色计算菌数BoulosL.提出了一种简便、快速计量活菌/死菌的方法,他用两种染料对样品染色。一种是SYTO9,分子量约为10Da的绿色染料,它可以进入活的或死的细胞中;另一种是PropidiumIodide,分子量约为668Da的红色染料,它只进入死的细胞。第五十页，共59页。用新构建的标记载体对甲基对硫磷降解菌DLL-1进行GFP发光基因标记菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLLBR-45B:DLL-1菌落在紫外灯下的发光检测(LB)A:DLL-1B:DLLTR-45pBBRGFP-45pTRGFP-45DLL-1的标记与验证第五十一页，共59页。利用荧光标记的寡聚核苷酸探针标记16SrRNA或23SrRNA，然后进行原位杂交探测，可以在原位状态下探测特定生物细胞，并可提供部分关于形态、空间分布等方面的信息。通过FISH技术可以解决在固定群落中微生物的分布问题。原始的生物膜和絮状污泥用多聚甲醛固定在凝胶包被的玻璃上，固定并已穿孔的细胞与荧光标记的寡核苷酸探针杂交，DNA探针就会与细胞中互补的DNA或RNA杂交；然后在荧光显微镜下就可以观察到发光的细胞，偶联的FISH在激光共聚焦显微镜下可以实现标记细胞在微生物菌落三维结构中的定位。荧光原位杂交（FluorescenceInSituHybridization）第五十二页，共59页。常用荧光原位杂交探针一览表探针名称系统类群序列SequenceTm（°C）Hyb/WashTemp（°C）[salt]（MNaCl）UNIVuniversalacgggcggtgtgtrcgwattaccgcggckgctg626437(0.5)ARCHArchaeagtgctcccccgccaattcct7343(0.5)BACTBacteria(EUB338)gctgcctcccgtaggagt6437(0.5)EUKEucaryagggcatcacagacctgtagaaagggcaggga585437(0.5)HiGCHighG+CGram+ccygatatctgcgca4537(0.5)LoGCLowG+CGram+tgtagcccargtcata5537(0.5)CFBFlavobacteriatcagtrccagtgtggggg5837(0.5)AlphaAlpha-proteoscgragttagccggggc5737(0.5)BetaBeta-proteostcactgctacacgyg5637(0.5)GammaGamma-proteoscttttgcarcccact4137(0.5)DeltaDelta-proteosgcttkcawgmagagg4737(0.5)SRB2Sulfate-reducerscgygcgccrctytact5737(0.5)PseudoPseudomonassp.ccttcctcccaactt5237(0.5)GSulfGreenSulfurcttttargggatttcctctg5437(0.5)EuryEuryarchaeotacttgcccrgcccttgacctaccgtngyccr585242(0.5)CrenCrenarchaeotaccagrcttgccccccgct7242(0.5)第五十三页，共59页。FISH常用荧光素