分子生物学课件

分子生物学课件第1页，共56页，2023年，2月20日，星期三基因操作(genemanipulation)基因工程(geneengineering)遗传工程genecloningmolecularcloning基因操作的核心部分为重组DNA技术。RecombinationDNAtechnology第2页，共56页，2023年，2月20日，星期三基因工程与建筑工程生物反应器3第3页，共56页，2023年，2月20日，星期三DNARecombination1定义：

对目的基因进行体外重组，再将重组分子导入受体细胞，使这个基因在受体细胞中复制、转录、翻译表达的过程。克隆（clone）：n,无性繁殖系及其后代。基因完全相同;v,指从同一祖先产生这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。

（Gene,cell,个体）20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。第4页，共56页，2023年，2月20日，星期三理论上三大发现：Avery肺炎双球菌转化实验：

证实了遗传物质的本质是DNA（1944年）Watson

和Crick：

提出DNA双螺旋结构模型（1953年）Nirenberg等：

确定了遗传信息的传递方向（1961-1966年）

DNA

RNA蛋白质第5页，共56页，2023年，2月20日，星期三技术上三大发明：工具酶：分子手术刀，切割与缝合基因，包括限制性内切核酸酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。

载体(vector,vehicle)：本意是媒介体，在基因工程上指能将目的基因导入宿主细胞的DNA分子。

逆转录酶（reversetranscription,RT)：打破了中心法则，使真核基因制备成为可能，RT-PCR。

RNADNA第6页，共56页，2023年，2月20日，星期三genemanipulation过程1、目的基因的获取（PCR,genelibrary)；2、载体(vector)的选择与构建(工具酶等）；3、目的基因与载体连接，构建重组DNA分子；4、重组DNA导入受体细胞，转化子筛选；5、受体细胞中目的基因的功能表达。第7页，共56页，2023年，2月20日，星期三基因工程的基本过程

分(合成)、切、连、转、选、鉴第8页，共56页，2023年，2月20日，星期三重组DNA技术的意义打破了自然种的界限真核/原核生物间基因的交流对生物进行定向改造基因治疗（基因矫正/添加，RNAi）基因工程药物（生长激素，细胞生长因子，重组疫苗等）第9页，共56页，2023年，2月20日，星期三组织纤溶酶原激活物（tissueplasminogenactivator，tPA）Oneexample---

10第10页，共56页，2023年，2月20日，星期三How？载体，工具酶第11页，共56页，2023年，2月20日，星期三基因操作的工具酶限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)DNA聚合酶连接酶（Ligase）反转录酶(Reversetranscriptase)碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端转移酶等第12页，共56页，2023年，2月20日，星期三1、限制性内切酶定义：是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。EcoRI,HandIII,SalI第13页，共56页，2023年，2月20日，星期三命名：3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号第1字母（大写）产生该酶细菌的属名的第一字母；第2、3字母（小写）细菌的种名；第4字母（大写）细菌菌株名；罗马数字代表该菌株中发现的第几个酶。

EcoRI:Escherichiacoli

R

(大肠杆菌R株)14第14页，共56页，2023年，2月20日，星期三限制与修饰（Restriction-modification）细菌体内存在限制和修饰系统（R-M）对自身的DNA进行甲基化修饰，免受自己限制酶的分解，对外来的DNA通过限制性内切酶降解，一般是指对外源DNA侵入的限制。应用：正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现，应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解第15页，共56页，2023年，2月20日，星期三分类

根据限制性内切核酸酶的作用特点，分为三大类。第16页，共56页，2023年，2月20日，星期三I类限制性内切核酸酶Ⅲ类限制性内切核酸酶

第17页，共56页，2023年，2月20日，星期三是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切。Ⅱ类限制性内切核酸酶:18第18页，共56页，2023年，2月20日，星期三Ⅱ类限制性内切核酸酶识别序列的长度：一般为4-8个碱基，最常见6个碱基。识别序列的结构：大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。

回文结构：一条单链以中心轴对折可以形成互补的双链。

第19页，共56页，2023年，2月20日，星期三

粘性末端（cohesiveend）--在DNA双链的不同位置切割DNA，形成有单链突出的末端。

平末端（Bluntend）--在DNA双链的相同位置切割DNA分子。

限制酶产生的末端：第20页，共56页，2023年，2月20日，星期三常用的限制性内切酶21第21页，共56页，2023年，2月20日，星期三DNA连接酶（ligase）

作用：使DNA的3’羟基末端和5’磷酸末端形成3’-5’磷酸二酯键，将两段DNA连接起来种类：T4DNAligase

（噬菌体来源）

E.coliDNAligase注意：连接DNA片段是否粘端；反应温度（16℃）和时间22第22页，共56页，2023年，2月20日，星期三23第23页，共56页，2023年，2月20日，星期三DNA聚合酶复制（DNAReplication）:

亲代DNA双链分子(D.SDNA)在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子(S.SDNA)为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成两条与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。24第24页，共56页，2023年，2月20日，星期三DNA5’…ATGACTG…3’3’…TACTGAC…5’RNA5’…AUGACUG…3’转录：以S.SDNA为模板，在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下….逆转录：….依赖RNA的DNA聚合酶…DNA聚合酶25第25页，共56页，2023年，2月20日，星期三DNA聚合酶与DNA复制26第26页，共56页，2023年，2月20日，星期三常用的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ；E.coliDNApolymeraseⅠ的Klenow片段（Klenow酶）；耐热DNA聚合酶；反转录酶27第27页，共56页，2023年，2月20日，星期三DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolymeraseⅠ）及其大片段（Klenow片段）35KD76KD枯草蛋白酶水解Klenow片段28第28页，共56页，2023年，2月20日，星期三大肠杆菌DNA聚合酶I的酶活性5‘-3’DNA聚合活性3‘-5’外切酶活性5‘-3’外切酶活性Klenow片段的酶活性5‘-3’DNA聚合酶活性3‘-5’外切酶活性29第29页，共56页，2023年，2月20日，星期三主要用途:用切口平移法（nicktranslation）标记DNA，制备探针。30第30页，共56页，2023年，2月20日，星期三5‘-3’外切酶活性5‘-3’DNA聚合活性3‘-5’外切酶活性31第31页，共56页，2023年，2月20日，星期三耐热DNA聚合酶

TaqDNA酶是一类耐热的DNA聚合酶。具有5’-3’聚合酶活性和5’-3‘外切酶活性多数Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性，反应温度～70℃

PCR（polymersechainreaction,聚合酶链式反应)32第32页，共56页，2023年，2月20日，星期三逆转录酶（ReverseTranscriptase）

催化以RNA为模板的聚合反应，称依赖RNA的DNA聚合酶。以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA(complementaryDNA)；RT-PCR常见的逆转录酶:AMV:禽病毒来源反应温度42℃

MMLV:鼠来源病毒反应温度38℃

33第33页，共56页，2023年，2月20日，星期三RT-PCR34第34页，共56页，2023年，2月20日，星期三末端转移酶（terminaltransferase）活性：催化dNTP加到3’羟基末端用途：制造人工粘端进行末端标记35第35页，共56页，2023年，2月20日，星期三碱性磷酸酶alkalinephosphatase

作用：去除5’磷酸基团，防止自身连接。种类：BAP-细菌性碱性磷酸酶

CIP-牛小肠碱性磷酸酶用途：基因克隆中防止载体自身环化

36第36页，共56页，2023年，2月20日，星期三其它：多聚核苷酸激酶：提供磷酸基团RNase-ribonucleaseDNase-deoxyribonuclaese37第37页，共56页，2023年，2月20日，星期三基因操作的载体携带目的基因进入宿主细胞的运载工具（vector）质粒载体λ噬菌体(Lambdaphage)第38页，共56页，2023年，2月20日，星期三克隆载体：目的基因的克隆、扩增序列分析等表达载体（expressionvector）：表达外源基因,带有启动子，核糖体结合位点以及表达标签等。原核表达载体：E.coli真核表达载体：酵母，哺乳动物，昆虫细胞表达载体39第39页，共56页，2023年，2月20日，星期三腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase,ADA)SevereCombinedImmunodeficiency,重症联合免疫缺陷40第40页，共56页，2023年，2月20日，星期三载体的条件：1含有独立自主复制起点，便于在宿主中扩增；2一个或多个筛选标记，如抗性基因-氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr)；表型的显色反应等。3多克隆位点，便于目的基因的克隆。4高拷贝，便于分离提纯。第41页，共56页，2023年，2月20日，星期三筛选标记：

用来区别重组质粒与非重组质粒。当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。

第42页，共56页，2023年，2月20日，星期三筛选标记：

当一个外源DNA片段克隆到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。用来区别重组质粒与非重组质粒。

α-互补：（α-complementation）蓝白斑筛选

第43页，共56页，2023年，2月20日，星期三插入失活(pBR322)

该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。

第44页，共56页，2023年，2月20日，星期三多克隆位点（MultipleCloningSite）是一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性酶切位点，以利于不同来源的外源DNA片段插入载体。第45页，共56页，2023年，2月20日，星期三质粒载体(plasmidvector)1.概念：细菌染色体以外的，能自主复制双链闭合环状DNA分子。其大小可从2-3kb到200kb（kilobase)左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制,赋予寄主一些新的遗传性状。

第46页，共56页，2023年，2月20日，星期三2.质粒载体分类质粒拷贝数(plasmidcopynumbers)：

指细菌中质粒的分子个数,常用质粒数/每染色体来表示。严紧型质粒和松弛型质粒47第47页，共56页，2023年，2月20日，星期三松弛型质粒(relaxedplasmid)：

复制只受本身的遗传结构的控制，有较多的拷贝数。严紧型质粒(stringentplasmid)：在寄主细胞内的复制除了受本身复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少。第48页，共56页，2023年，2月20日，星期三Example:pBR322质粒

第49页，共56页，2023年，2月20日，星期三pUC18/1950第50页，共56页，2023年，2月20日，星期三噬菌体phagevector感染细