分解纤维素的微生物的分离

分解纤维素的微生物的分离.第1页，共32页，2023年，2月20日，星期三纤维素：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物；纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；第2页，共32页，2023年，2月20日，星期三1、在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。2、农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；

纤维素生物燃料：

最有希望替代石油能源

科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料（甚至是航空燃油）。第3页，共32页，2023年，2月20日，星期三课题3分解纤维素的微生物的分离第4页，共32页，2023年，2月20日，星期三1.纤维素：是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。有些微生物能分解利用纤维素，因为它们能够产生纤维素酶。2.纤维素酶：是一种复合酶，一般包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。3．筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。其原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。4．纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，也可以将富含纤维素的物质埋在土壤中，经过30天左右，再从已腐烂的物质埋藏处筛选纤维素分解菌。自主学习答案第5页，共32页，2023年，2月20日，星期三5．在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前，可以用选择培养基增加纤维索分解菌的浓度。培养时要在摇床上振荡培养。6．常用的刚果红染色法有两种：一种是先培养微生物，再加入刚果红染色；另一种是在倒平板时就加入刚果红。7．经过刚果红鉴别培养基培养后，在产纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。可以用单细胞挑取法挑取纤维素分解菌。8．为确定得到的是纤维素分解菌，尚需进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法一般采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定理测定。第6页，共32页，2023年，2月20日，星期三一、基础知识1.纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。第7页，共32页，2023年，2月20日，星期三

土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。第8页，共32页，2023年，2月20日，星期三2.纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素一、基础知识第9页，共32页，2023年，2月20日，星期三

在2支20mL的试管中，分别放入1×6cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液10mL、11mL。在加入10mL缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶（70~80U/mL）。将二支试管固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应1h，观察结果。1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。

第10页，共32页，2023年，2月20日，星期三在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；〖思考1〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？滤纸崩溃法第11页，共32页，2023年，2月20日，星期三（2）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法______________。该方法可以通过________反应直接筛选。刚果红染色法颜色2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成____________，当纤维素被_________分解后，红色复合物无法形成，出现以_____________为中心的________，可以通过___________________________来筛选纤维素分解菌。红色复合物纤维素酶纤维素分解菌

透明圈是否产生透明圈第12页，共32页，2023年，2月20日，星期三可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌第13页，共32页，2023年，2月20日，星期三练一练：1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖第14页，共32页，2023年，2月20日，星期三2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是A.刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛

选出了纤维素分解菌第15页，共32页，2023年，2月20日，星期三(三)、实验设计土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别培养基挑选菌落什么样的环境取样?①培养的目的?②选择培养基的特点?挑选什么样的菌落?①鉴别培养基的特点?②如何鉴别?根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；刚果红染色法第16页，共32页，2023年，2月20日，星期三【思考3】实验流程中“选择培养”的培养基类型是什么？该培养的目的是什么？【思考4】本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？答：液体选择培养基。其目的是使纤维素分解菌增殖，含量增多。答：不同点：尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。相同点：其它操作基本共同。第17页，共32页，2023年，2月20日，星期三活动探究4：阅读资料一“土壤取样”，回答下列问题：思考5：为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？答：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用，只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境，从而提高获得目的微生物的几率。思考6：将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？答：人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。第18页，共32页，2023年，2月20日，星期三1、纤维素分解菌选择培养基属于______（固体、液体）培养基，原因是__________活动探究5：阅读选择培养基阅读资料二“选择培养基”，回答以下几问题：液体没有添加琼脂2、该培养基对微生物_____（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是____________________________________________________________________________

具有以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖；第19页，共32页，2023年，2月20日，星期三若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将__________改为_________。3、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？葡萄糖纤维素粉第20页，共32页，2023年，2月20日，星期三培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)第21页，共32页，2023年，2月20日，星期三【资料三】刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应方法二：在倒平板时就加入刚果红第22页，共32页，2023年，2月20日，星期三方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！第23页，共32页，2023年，2月20日，星期三染色法优点缺点方法一

方法二

颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便，不存在菌落混杂问题

产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。思考：这两种方法各有哪些优点与不足第24页，共32页，2023年，2月20日，星期三比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法刚果红染色法第25页，共32页，2023年，2月20日，星期三

在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯化培养。第26页，共32页，2023年，2月20日，星期三挑选产生透明圈的菌落

挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯培养。纯化培养第27页，共32页，2023年，2月20日，星期三四、结果分析与评价

1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2.分离的结果是否一致

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。第28页，共32页，2023年，2月20日，星期三如何判断生物为自养型还是异养型？碳源：凡是能够为微生物生长繁殖提供碳源的营养物质叫作碳源。自养型生物：碳源为无机态的碳源，如：CO2、碳酸氢钠等为无机碳源。（1）光能自养:绿色植物、光合细菌(2)化能自养:硝化细菌、硫细菌、铁细菌异养型生物：碳源为有机碳源。如：糖类（葡萄糖、蔗糖等）、蛋白胨、脂肪酸、石油等。异养型:人、动物、大多数真菌、大多数细菌注：看微生物的同化类型是看碳源类型，与氮源无关。有些异养型微生物也可以利用无机态氮源，如根瘤菌和圆褐固氮菌。第29页，共32页，2023年，2月20日，星期三

为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_____________实验，纤维素酶的发酵方法有______发酵和______发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________含量进行定量测定。发酵产纤维素酶

液体

固体

葡萄糖

五、课题延伸第30页，共32页，2023年，2月20日，星期三分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结第