动物细胞培养与表达制备药用蛋白

动物细胞培养与表达制备药用蛋白第1页，共79页，2023年，2月20日，星期四本章主要内容1.动物细胞培养的概念、历史2.动物细胞培养的特点3.动物细胞培养工具与条件4.体外培养细胞生长与增殖过程5.细胞株与保存6.动物细胞小规模培养7.动物细胞大规模培养8.动物细胞培养生物反应器9.动物细胞大规模培养影响因素10.动物细胞表达制备药用蛋白第2页，共79页，2023年，2月20日，星期四§11-1动物细胞培养概念与历史1、动物细胞培养（Animalcellculture）：是模拟体内生理环境使动物细胞在体外增殖、生存的一种技术。包括：原代培养：动物细胞进行首次传代前的培养过程。传代培养：将原代培养细胞继续转接培养的过程。2、历史：1907年,哈里森（Harrison）采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔（C（Carrell）设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大推动了动物细胞培养技术的建立。1951年，厄尔利（Earle）等人开发了动物细胞体外培养的培养基。伴随着培养工具与培养基的不断完善，动物细胞体外培养技术日益成熟。第3页，共79页，2023年，2月20日，星期四§11-2动物细胞培养的特点1、动物细胞无细胞壁，比微生物细胞大2、动物细胞倍增时间长，生长缓慢3、培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。5、原代细胞培养繁殖50代左右即退化死亡。6、对营养需求更加苛刻，除常规营养外还需血清等。7、对培养条件或环境极其敏感。8、容易受污染。9、大多需要贴附在固体或半固体表面才能生长。（一）动物细胞培养特点第4页，共79页，2023年，2月20日，星期四体外生长的动物细胞一般具有贴附性、细胞接触抑制性、密度抑制性的特点。悬浮型细胞：与微生物、植物细胞不同，动物细胞中只有极少数细胞体外生长可在培养液中悬浮生长，培养密度高、效率高。血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。P981、类型：贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附着在固体或半固体表面才能生长，另外也包括细胞间相互接触。（二）动物细胞培养类型与形态第5页，共79页，2023年，2月20日，星期四接触抑制性(Contactinhibition)是指由于动物细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象（图）。由于这个特性，正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。密度抑制(Densityinhibition)细胞接触汇合成片后，细胞仍能进行增殖分裂。但是当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制生长现象。第6页，共79页，2023年，2月20日，星期四（1）成纤维型细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形，中央有圆形核，胞质向外伸出2－3个长短不同的突起，成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。除成纤维细胞外，心肌、成骨肌细胞等起源于中胚层细胞培养时均属这一类型。2、贴附型细胞四种形态第7页，共79页，2023年，2月20日，星期四（2）上皮型细胞类似上皮细胞的细胞，特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状”。包括：皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等起源于内或外胚层细胞。第8页，共79页，2023年，2月20日，星期四（3）游走型细胞细胞呈分散生长，一般不连接成片，胞质常伸出伪足和突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则，在器皿上生长位置不固定。此型细胞不稳定，外形不断变化，密度大时难以和成纤维、上皮细胞相区别。包括单核巨噬细胞系统：白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等。第9页，共79页，2023年，2月20日，星期四（4）多形型细胞

多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，包括细长型胞突和多角形胞体。多形型细胞不常见，体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。实际上，体外培养的动物细胞形态常受培养条件影响，呈现过渡形态。第10页，共79页，2023年，2月20日，星期四1、培养工具多为玻璃或无毒塑料制成的：培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。培养皿培养管仪器包括：CO2培养箱、相差显微镜等。目前大多采用微载体(多孔塑料培养板)作为介质培养贴附型细胞生长，类似悬浮培养效果。§11-3动物细胞培养工具与条件另外，同微生物、植物细胞培养不同，动物细胞培养的培养基与其他溶液不能经受高温灭菌，多采用40nm过滤除菌（例如支原体污染。第11页，共79页，2023年，2月20日，星期四2、培养条件温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为37℃。细胞对低温耐受性更强，40℃高温数小时可使细胞死亡。pH：哺乳动物细胞为7.2~7.4，耐酸不耐碱。渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发生皱缩或肿胀，甚至破裂。BSS溶液。气体：细胞的生长代谢离不开O2和CO2

。二氧化碳培养箱供应CO2

，还可调节pH值。第12页，共79页，2023年，2月20日，星期四3、动物培养基对于营养要求非常苛刻，包括必需氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子、血清等。分为：天然、合成、无血清培养基三种。第13页，共79页，2023年，2月20日，星期四（1）天然培养基常用动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。优点：营养价值高，培养效果好缺点：成分复杂、来源有限、成本较高血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝或去纤维蛋白法)的血浆。第14页，共79页，2023年，2月20日，星期四血清的生物功能1.提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。2.提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。3.提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。第15页，共79页，2023年，2月20日，星期四4.对培养中的细胞起到某些保护作用：提供促接触和伸展因子，使细胞贴壁免受机械损伤。血清蛋白形成的粘度，可以保护细胞搅拌时免受机械损伤。血清中含有抗蛋白酶成分，可以使用血清来终止内皮细胞、骨髓样细胞释放胰蛋白酶的消化作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如硒等。第16页，共79页，2023年，2月20日，星期四（2）合成培养基优点：成分已知，便于对培养条件进行控制。缺点：无法替代天然培养基中一些未知成分解决途径——合成培养基中添加小牛血清，彼此互补目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等，具体配方参见本章附录（P123）第17页，共79页，2023年，2月20日，星期四例如MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的无机盐，组成简单。DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培养。第18页，共79页，2023年，2月20日，星期四（3）无血清培养基血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分血清培养基缺点：（1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用.（2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。（3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。第19页，共79页，2023年，2月20日，星期四无血清培养基无血清培养基(Serumfreemedium,SFM)是不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加已知组分组成。试图全部替代血清成分。基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。添加组分主要包括：生长因子、激素（胰岛素、胰高血糖素等）、结合蛋白与转铁蛋白、细胞外基质、酶抑制剂等。第20页，共79页，2023年，2月20日，星期四4、动物细胞培养常用溶液（1）平衡盐溶液（Balancedsaltsolution，BSS

）主要由生理盐水和葡萄糖组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。例如：Hanks液、Earle液（缓冲能力强）注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。第21页，共79页，2023年，2月20日，星期四（2）培养基pH调整液动物细胞对酸碱度要求十分严格，大部分合成培养液都呈微酸性，若灭菌前调整到标准值，灭菌后又会降低，因此pH调整液应单独配制和灭菌，在培养液灭菌后再加入调整pH值最好。常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。注：HEPES（4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离子两性缓冲液，其在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力：第22页，共79页，2023年，2月20日，星期四（3）细胞消化液使用目的：培养前让组织块消化解离成分散细胞，或传代培养时使细胞脱离器皿表面并分散解离。胰蛋白酶溶液：水解细胞间的蛋白质，使细胞分散，使用浓度0.125或0.25%，用无Ca2+、Mg2+的Hanks或PBS缓冲液配制，pH值6.8-7.2，2-10分钟消化完后加血清终止反应。乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：非酶性解离细胞，毒性小、经济、操作方便，使用浓度0.02%。注：若将两者结合使用，解离效果更好：

EDTA：胰蛋白酶体积比=1：1或2：1第23页，共79页，2023年，2月20日，星期四（4）抗生素溶液作用：防止微生物污染。常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。通常是青霉素和链霉素联合使用：培养基内最终使用浓度为青霉素100U/ml、链霉素100微克/ml（双抗）。第24页，共79页，2023年，2月20日，星期四1、动物细胞体外培养的一般过程一般经过：组织获得与消化、接种、原代培养、传代培养几个环节11-4动物细胞培养生长和增殖过程★原代培养期★传代期★衰退期第25页，共79页，2023年，2月20日，星期四图11-8动物细胞培养过程生长曲线第26页，共79页，2023年，2月20日，星期四2、动物细胞原代培养原代培养（Primaryculture）：从体内取出组织接种直接长出单层细胞到第一次传代培养前的阶段（一般持续1-4周）。特点：在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛，细胞多呈二倍体核型。这样的细胞称为原代细胞。优点：细胞生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内的形态学特征，是药物测试、研究细胞分化等很好的实验材料。第27页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.1组织块原代培养法

是比较常用早期简易的原代培养方法：（2）接种与培养：用吸管吸出组织块，放入培养瓶内，每小块间隔0.5厘米，使其均匀贴在培养瓶的壁上（可涂血清）。然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，将培养瓶缓慢翻转使培养液覆盖组织块，倾斜置于37℃的CO2培养箱内静置培养。（3）生长周期：一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从组织块四周长出，24小时后可再补充培养液，3-5天即可形成单层细胞再更换培养液即首次传代培养，若5-7天组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落。（1）组织块的分离：将组织块剪碎成1mm3大小，加Hanks缓冲液，用吸管吸打，离心，收集沉淀即为组织块。也可用注射器挤压，或用网筛分离得到细小的组织块。第28页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.2组织消化原代培养法（1）取材与消化—酶解法制备单细胞根据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得动物细胞团或单个细胞，然后进行培养。最常用的有胰蛋白酶和胶原酶，此外链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。消化传代细胞常用EDTA与胰蛋白酶一起使用。•胰蛋白酶法适用消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等•胶原酶解：适用于结缔、上皮、癌组织等，使胶原酶最终浓度为200u/ml，36.5℃，静置4—48小时，上面悬液经离心获得或纤维细胞沉淀，沉淀重置于生理盐水，去掉未解向组织块后沉淀得到上皮样细胞。第29页，共79页，2023年，2月20日，星期四组织消化原代培养示意图第30页，共79页，2023年，2月20日，星期四1.检查细胞形态及活力：倒置显微镜下观察培养瓶中原代细胞，生长良好者轮廓不清晰，较透明；生长不良者反而轮廓清晰，形态不规则，胞内有空泡、颗粒等。四唑氮蓝法(MTT)法可以检测细胞活力：活细胞的线粒体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨（Formazan)并沉淀在细胞中。2.培养液pH及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色，pH在7.2～7.4之间。CO2的积累使培养液pH下降，当超出缓冲范围时，培养液变黄，需要3～4天更换一次培养液。CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。细菌污染时培养液变浑浊；支原体易透过滤器，污染不易被发现。（2）原代培养期检查第31页，共79页，2023年，2月20日，星期四倒置显微镜：组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。第32页，共79页，2023年，2月20日，星期四3、动物细胞传代培养传代培养（Passageculture/Subculturing）是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程，一般可传代50代左右。传代培养期间的细胞称为细胞系。注意：每进行一次分离再培养称为传一代，即从细胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。在细胞的一代中，细胞约能倍增3～6次。第33页，共79页，2023年，2月20日，星期四传代培养方法悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接吹打分散传代，或者采用自然沉降法加入新鲜培养基后再吹打分散进行传代。贴壁生长的动物细胞，原代培养细胞分裂增殖扩展成片后需要进行细胞分离重新接种培养。一般采用酶消化法进行传代培养。视频：动物细胞培养技术:/v_show/id_co00XOTE5MDQzMg==.html第34页，共79页，2023年，2月20日，星期四酶消化传代过程1、吸出或者倒掉培养瓶内的旧培养液。2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底，轻轻摇动培养瓶。3、2～5分钟后检查，有细胞间隙变大、细胞质回缩现象时添加培养液终止消化。4、吸出消化液，加入Hanks液轻轻转动，洗去残留消化液。5、加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液。6、计数，接种进行传代培养。第35页，共79页，2023年，2月20日，星期四动物细胞的传代培养第36页，共79页，2023年，2月20日，星期四11-5细胞株与保存1.细胞系(Cellline)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。不能连续培养的为有限细胞系(Finitecellline)，能连续培养下去的为连续细胞系(Infinitecellline)。2.细胞株(Cellstrain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。第37页，共79页，2023年，2月20日，星期四3动物细胞株类型包括：原代细胞、传代细胞有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理想的药物生产细胞）二倍体细胞、异倍体细胞融合细胞、转化细胞、基因工程细胞第38页，共79页，2023年，2月20日，星期四（1）原代细胞常用有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液淋巴细胞1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞生产脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进行生物制药的先河。缺点：具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等。药物筛选、药理研究。第39页，共79页，2023年，2月20日，星期四（2）二倍体传代细胞二倍体细胞具有正常细胞的特点：二倍体染色体、具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。有限细胞系（传代次数一般都不超过50代）。WI-38：1961年Wister38研究所从女性高加索人的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI-38。培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用于生产的二倍体细胞有对病毒敏感，第一个用于疫苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。第40页，共79页，2023年，2月20日，星期四（3）融合细胞如杂交瘤细胞：脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞。用于抗体药物生产。将药用蛋白基因转化入动物细胞培养，用于大量生产药物。（4）基因工程细胞第41页，共79页，2023年，2月20日，星期四（5）转化细胞细胞转化是指细胞发生遗传改变而产生永生化，即由限定性细胞系转化为连续性细胞系，可以在体外进行无限传代和生长繁殖。不同于癌细胞，没有致瘤性。倍增时间短，对培养条件与生长因子要求低。由于转化细胞常常由于染色体断裂而变成异倍体，失去正常细胞的特点。转化细胞于20世纪80年代获得批准用于生产。第42页，共79页，2023年，2月20日，星期四转化方法1.细胞自转化体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。2.人工诱发转化采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。第43页，共79页，2023年，2月20日，星期四CHO细胞(Chinesehamsterovarycell)：从中国仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活剂(Tissueplasminogenactivator，tPA)、促红细胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（HepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg）、粒细胞集落刺激因子（Granulocytecolonystimulatingfactor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。比二倍体减少1条(2n-1)或几条染色体的细胞称亚二倍体第44页，共79页，2023年，2月20日，星期四Vero细胞（Verocell）:是1962年日本从非洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。第45页，共79页，2023年，2月20日，星期四BHK-21细胞（Babyhamsterkidneycell）：是1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白(例如重组凝血因子VIII)。第46页，共79页，2023年，2月20日，星期四（1）先酶消化分散成单个细胞，用冷冻保护液（含10%血清的培养液+10%甘油或二甲基砜DMSO）冷却，同时将细胞稀释成2~5*106个/ml。（2）分装：1ml/安瓶（3）冷冻机内冷冻至-25℃（4）液氮罐长期冷冻保存。（5）细胞复苏：37℃水浴快速融化4动物细胞冷冻保存第47页，共79页，2023年，2月20日，星期四1、悬滴培养•是最早建立的体外培养技术，是组织和器官培养的经典方法。•将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将待培养的组织或器官植块放于铺展开的培养液中央部位，然后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封后进行培养。11-6动物细胞小规模培养2、灌注小室培养是在悬滴法基础上的改进，实现营养液的循环供应与流出。第48页，共79页，2023年，2月20日，星期四3培养瓶培养法1923年，卡雷尔（Carrel）设计成功卡氏瓶，可以保证动物细胞培养的无菌环境和生长空间。培养瓶培养法是目前动物细胞小规模培养的主要方法之一。培养对象直接接种于培养瓶内再放入培养箱第49页，共79页，2023年，2月20日，星期四4培养板培养法接种在培养板孔（48、96）内，然后置于CO2培养箱培养。目前常规方法之一。第50页，共79页，2023年，2月20日，星期四5转管培养法1933-1934年，盖尔（Gey）和刘易斯（Lewis）建立了旋转管培养方法，将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上旋转培养。旋转管培养方法克服了静置培养的不足，例如：细胞生长环境不均匀、不利于营养的吸收等，培养物可以交替地接触培养液和气体环境，利于细胞或组织生长。6转瓶培养法将转管换成培养瓶，增加了培养液与空气接触面积第51页，共79页，2023年，2月20日，星期四1悬浮培养是指细胞在反应器培养液中自由悬浮生长。主要用于非贴壁依赖型的少数细胞培养：杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞，某些肿瘤细胞等。贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。11-7动物细胞大规模培养优点：细胞呈单个游离态存在，传代时无需再消化分散；增殖快，产量高，培养过程简单。第52页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.微载体培养微载体（Microcarrier）：是直径60-250μm的带正电荷微粒（葡聚糖聚合物），适于贴壁型细胞生长。1967年，维茨尔（VanWezel）开发了微载体系统。微载体培养成既能满足动物细胞的贴壁要求，又能使微珠悬浮起来，实现3D培养，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制（面积有限，占用空间大，细胞产率低，监控不便，劳动强度大）。第53页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.1微载体特点1.良好的生物相容性、无毒无害2.有好的黏附性，一般带正电荷3.大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一4.良好的传质性能5.强的机械性能：重复利用、保护细胞6.好的热稳定性：能高压灭菌第54页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.2微载体分类1.实心微载体优点：易于细胞在表面贴壁，机械强度高，容易接种操作缺点：细胞浓度低；细胞容易受剪切力、搅拌、碰撞等影响；细胞易老化脱落。2.多孔微载体优点：比表面积更大生长空间大；内部生长可使细胞免受机械损伤；易固定化培养，可以采用高的搅拌速度和通气量，强化传质。缺点：容易产生营养传递障碍，积聚代谢副产物。第55页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.3微载体培养细胞方法1、选择合适的微载体类型：细胞贴壁率高、细胞容纳量大等。2、浸泡水化及消毒：用含Ca2+、Mg2+的PBS浸泡微载体3h，洗涤1次，高压灭菌。3、接种：根据不同细胞类型决定接种浓度。细胞在微载体表面的贴附是关键，主要取决于细胞与微载体的接触概率和亲和性，也与培养基组成（血清提供促接触和伸展因子）、要慢速搅拌等相关。多数细胞都可在24小时内贴壁。4、培养与观察、细胞计数：观察形态是否正常，并计数控制密度。第56页，共79页，2023年，2月20日，星期四第57页，共79页，2023年，2月20日，星期四1.游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。2.吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁。3.繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。出现接触性抑制。4.退化期：细胞长满载体表面，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞脱落死亡。微载体细胞培养生长过程第58页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.3微载体培养细胞方法酶消化法：碳酸氢钠碱性溶液浸泡，贴壁性差，使细胞脱落；用含EDTA的PBS缓冲液洗涤微球，胰蛋白酶-EDTA37℃浸泡搅动消化15min后，血清终止5、消化与细胞回收：细胞贴壁率高、细胞容纳量大等。6、细胞收获：离心沉降法(400r/min,2min)或100um过滤法。7、传代培养：“球传球”传代培养技术。第59页，共79页，2023年，2月20日，星期四球传球接种技术将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技术。优点：（1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、高效。（2）防止细胞调亡：通过定期更换微载体也能为细胞的分裂生长提供了新的生长空间，在长期培养过程中保持细胞活力，延长了细胞寿命，提高了细胞分泌物的产量。视频：/v_show/id_XNzA0NTc1NzI=.html第60页，共79页，2023年，2月20日，星期四机械搅拌式：浆叶改造充气搅拌式：需要改造微载体培养：解决空间分布与贴壁，连续灌注培养中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、连续灌注培养11-8动物细胞培养生物反应器第61页，共79页，2023年，2月20日，星期四细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维中外表面。柱式中空纤维生物反应器中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜。

主体是由微孔中空纤维管束制成的中空丝，纤维束由外壳包裹，因此可分为中空内腔与中空外腔两部分，每部分各有其进出口。新鲜培养液从中空内腔导入。气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体内部。无菌空气进出口第62页，共79页，2023年，2月20日，星期四中空纤维反应器第63页，共79页，2023年，2月20日，星期四板框式：平行排列的中空纤维床中心灌流式优点：克服了纤维轴向流动时营养供应与产物积累存在的浓度梯度多孔通气第64页，共79页，2023年，2月20日，星期四模拟细胞在体内生长的三维状态。既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。细胞如果是附壁性的，则附着在纤维外壳表面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化冲出；若是非附壁性的，应采用微滤材料将其截留在反应器内而让培养液排出。优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效率高。缺点：容易堵塞，价钱昂贵。柱式中空纤维生物反应器评价第65页，共79页，2023年，2月20日，星期四1、有毒物质或抑制因子产生氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长和蛋白糖基化。乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵解，能量产生减少，抑制细胞生长。甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在的损伤作用，改变有机物-NH3和-SH2。CO2：毒害细胞或改变代谢水平、增大细胞渗透压。11-9动物细胞大规模培养的影响因素第66页，共79页，2023年，2月20日，星期四原因：营养成分耗尽、有毒产物积累如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。渗透压：影响细胞生长、死亡速度，影响产物积累；载体：空间大小、孔隙大小，贴壁性、细胞移动性细胞死亡与凋亡：凋亡基因bcl-211-9动物细胞大规模培养的影响因素2、物理因素参数控制：在线监控pH、温度、氧气、搅拌等第67页，共79页，2023年，2月20日，星期四灌注培养1.减少细胞调亡（1）可以去除氨、乳酸、甲基乙二醛等代谢物质。（2）保证营养供给。2.连续性收获产品采取怎样的工艺操作才可以消除细胞凋亡，保证高的细胞浓度？第68页，共79页，2023年，2月20日，星期四11-10动物细胞表达制备药用蛋白大多数哺乳动物蛋白翻译后的修饰，例如：糖基化、磷酸化和乙酰化等，是保持生物学活性、稳定性及抗原性的前提。转基因微生物在生产分子量较小、结构较为简单的异源蛋白方面具有优越性，微生物表达系统合成的复杂真核蛋白存在折叠方式不正确、缺乏翻译后加工修饰等缺陷，动物细胞蛋白质表达系统可以较好地解决这些问题。第69页，共79页，2023年，2月20日，星期四1.动物转基因方法（1）物理法-电穿孔法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔，达到增加通透性的效果，从而使外源DNA转移至细胞中。简单、效率较高。第70页，共79页，2023年，2月20日，星期四DEAE-萄聚糖法早期使用转基因法，效率低。原理：带负电的DNA吸附在带正电荷的DEAE（二乙氨乙基）表面形成颗粒，通过胞饮作用进入胞内。（2）化学方法磷酸钙-DNA共沉法：比前者高，但转基因效率还较低。原理：形成磷酸钙-DNA沉淀颗粒，Ca2+能促使细胞膜脂裂开形成孔隙，使DNA进入，也可通过胞饮作用进入胞内。第71页，共79页，2023年，2月20日，星期四脂质体载体包埋法将需转移的外源DNA或RNA与脂质体混合，带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体内形成DNA-阳离子脂质体复合物。由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA