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枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析

2008.12.05实验目的从枯草芽孢杆菌中分离提取碱性磷酸酶进行酶活分析实验原理碱性磷酸单酯酶（EC:3.1.3.1）又称碱性磷酸酯酶，碱性磷酸酶，官方英文名为Alkalinephosphatase

碱性磷酸单酯酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中。其用途一般有：1）在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸。2）去除DNA片段5’磷酸以防止质粒DNA连接和自身环化。

最适温度37℃，最适pH10，对底物只具有相对的专一性，在碱性条件下水解磷酸酯：

单磷酸酯＋水醇＋磷酸

盐析根据不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同而利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出的方法称为蛋白质的盐析。实验材料枯草杆菌发酵液Tris－HCl缓冲液（pH7.4、9.5）1mol/LMgCl2

溶液40mmol/L对硝基酚磷酸（NPP）溶液实验步骤细胞培养与收集

每组取约50mL枯草杆菌发酵液8000rpm离心5min，收集菌体弃去上清。用pH7.4的Tris－HCl缓冲液洗涤菌体一次并弃去上清。碱性磷酸酶的提取

得到菌体沉淀后，每管加入5mLpH7.4的Tris－HCl缓冲液，使细胞重悬。然后再加入1mL1mol/LMgCl2

溶液，于室温振荡10min；8000rpm离心5min，取上清液即为粗酶液。取样测酶活。酶活测定溶液加量pH9.5Tris－HCl缓冲液750μLNPP250μL样品0.5ML37℃保温10min0.5mL0.5MNaOH终止反应稀释至10mL酶活力单位：在42

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