细菌内毒素检查验证方案

细菌内毒素检查验证方案文件编号：起草人：审核人：批准人：批准日期：年月日...目录1概述1精品文档放心下载2验证目的及范围1感谢阅读3验证小组人员组成及职责1精品文档放心下载4验证依据2精品文档放心下载5验证前准备2精品文档放心下载6验证的实施2谢谢阅读7偏差处理5谢谢阅读8验证数据及评估5谢谢阅读9验证报告及评审5精品文档放心下载10再验证及周期5感谢阅读11验证文件及归档5感谢阅读12附件5精品文档放心下载...1概述细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以谢谢阅读判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。精品文档放心下载细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显精品文档放心下载色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注感谢阅读射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。谢谢阅读2验证目的和方法本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、感谢阅读干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评感谢阅读价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。谢谢阅读3.验证小组人员组成及职责：3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。谢谢阅读3.2验证小组组成及职责列表组成职责1.负责起草验证方案的起草2.负责本方案的培训3.仪器仪表校验确认QC4.负责验证的实施

5.负责数据的收集和整理

6.负责数据分析感谢阅读7.负责完成验证报告1.负责验证方案、验证报告的审核与批准质量部2.负责验证现场的监督审查1.负责保障设备、器具的完好生产部2.负责动力系统的保障4验证依据《中华人民共和国药典》2015版1143细菌内毒素检查法谢谢阅读5.验证前准备5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对感谢阅读本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。精品文档放心下载...5.3相关文件，确认以下文件皆为现行有效版本。序号相关文件文件编号12感谢阅读3感谢阅读456感谢阅读7型谢谢阅读8精品文档放心下载9谢谢阅读106验证的实施6.1实验材料及用具6.1.1电子天平6.1.2.电热干燥箱6.1.3.恒温恒湿箱6.1.4.水银温度计6.1.5.旋涡混合器6.1.6.鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号）6.1.7.细菌内毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品)谢谢阅读6.1.8.0.015EU/ml，精品文档放心下载且对内毒素试验无干扰作用。6.1.9.实验用具:75%酒精感谢阅读棉、剪刀、砂轮。6.2实验准备6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸感谢阅读泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍精品文档放心下载...以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置谢谢阅读入烤箱。6.2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至精品文档放心下载250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1小时。达到规定时间后，精品文档放心下载感谢阅读如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干谢谢阅读烤除去可能存在的外源性内毒素。6.3鲎试剂灵敏度复核试验本试验采用凝胶法，凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度感谢阅读检测的方法。6.3.1细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上精品文档放心下载75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准精品文档放心下载品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，感谢阅读置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，感谢阅读即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应谢谢阅读在旋涡混合器上混合30秒钟。6.3.2待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻精品文档放心下载75%0.1ml检查用谢谢阅读水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。感谢阅读6.3.3.加样将已充分溶解的待复核鲎试剂1854列4谢谢阅读1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ、和0.25精品文档放心下载λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水，作为阴性对照。谢谢阅读6.3.4加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，垂直放谢谢阅读入试管架上，连同试管架放入37℃±1℃恒温恒湿箱中，试管架保持水平状态，保温谢谢阅读60±2分钟。...6.3.5观察并记录结果。将试管架从恒温恒湿箱中轻轻取出，避免振动，将每管拿出感谢阅读缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录感谢阅读+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。保精品文档放心下载温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。6.3.6实验结果计算如最大浓度2λ40.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实感谢阅读λcλ=lg-1(∑X/4)c式中xlg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶谢谢阅读液中最后一个呈阳性结果的浓度。6.3.7结果判断6.3.7.1.判断标准当λ在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用cλ感谢阅读6.3.7.2判断结果：（记录附后）6.4干扰实验6.4.1目的是检验本公司自制的注射用水对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的感谢阅读供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。精品文档放心下载6.4.2确定最大有效稀释倍数（MVD）注射用水的内毒素限值L为0.25EU/ml，鲎试剂的标示灵敏度为0.25EU/ml，则最感谢阅读大有效稀释倍数MVD为注射用水本身浓度。公司如下：MVD=cL/λ式中：L为供试品的细菌内毒素限值c为供试品溶液浓度λ为鲎试剂灵敏度的标示值。6.4.3制备内毒素标准对照溶液...取14个浓度的标准溶液即2λ、感谢阅读λ、0.5λ、0.25λ（方法同6.3.1）。谢谢阅读6.4.4制备含内毒素的供试品溶液再注射用水将6.4.3.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λλ0.5λ、谢谢阅读0.25λ的含内毒素的供试品溶液。6.4.5鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂28支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划精品文档放心下载痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶感谢阅读解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。6.4.5加样：按下列表1方法进行加样1)将准备好的鲎试剂取其中185列，4列4谢谢阅读1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5精品文档放心下载λ0.25λ2支（管）加入0.1ml供试品溶液谢谢阅读作为阴性对照。2)将另外10支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，每列2支（管）。其中的4感谢阅读列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ1.0λ0.5λ0.25λ的内毒素的标准感谢阅读2支（管）加入0.1ml检查用水作为样品阴性对照。加样结谢谢阅读37±1℃谢谢阅读恒温恒湿箱中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。1A214B液24448412C242282D2注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；CD精品文档放心下载...为阴性对照。6.4.7实验结果计算只有当溶液A和阴性对照溶液DC的结果符合精品文档放心下载B的结果符合鲎试剂里面的谢谢阅读复核试验要求室，认为该供试品溶液物干扰作用。其他情况则认为供试品溶液存在干感谢阅读扰作用。按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值感谢阅读(E)和用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(E).精品文档放心下载stE=lg-1(∑X/4)ssE=lg-1(∑X/4)ttXX分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度精品文档放心下载st的对数值（lg）。6.4.8结果判断6.4.8.1判断标准当E在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且E在0.5E～2.0E（包括0.5E感谢阅读stsss和2.0E）时，则认为该供试品溶液不干扰实验，可对此供试品进行细菌内毒素检查。谢谢阅读s当E不在0.5E～2.0E（包括0.5E和2.0E）时，则认为该供试品溶液干扰实验。谢谢阅读tssss6.4.8.2判断结果：（记录附后）。6.5供试品的凝胶限度试验检查6.5.1在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，谢谢阅读同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。6.5.2凝胶限度溶液的制备：按表2进行各试验溶液的制备感谢阅读1A2B2C2D2...谢谢阅读6.5.2.1供试品溶液的制备：取公司自制的注射用水，不需进行稀释处理。感谢阅读6.5.2.2阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ6.3.1感谢阅读6.5.2.3供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。（方法同感谢阅读6.4.4制备含内毒素的供试品溶液）。6.5.2.4阴性对照液用细菌内毒素检查用水6.5.3鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划感谢阅读痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶谢谢阅读解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。6.5.4加样取82支（A0.1ml供试品溶液作为供试品管，精品文档放心下载2支（B）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管，2支(C)加入0.1ml阳精品文档放心下载性对照溶液作为阳性对照管，2支(D)加入0.1ml检查用水作为阴性对照管。精品文档放心下载6.5.537℃±1℃恒温恒湿箱谢谢阅读中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。精品文档放心下载6.5.6结果判断6.5.6.1判断标准若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，谢谢阅读阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液A的两个平行管均谢谢阅读A感谢阅读需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合谢谢阅读规定，否判定供试品不符合规定。6.5.6.2判断结果：（记录附后）...7.偏差处理精品文档放心下载进行处理并如实记录，给出合理的偏差处理措施，并上报验证领导小组，记录备案，感谢阅读并且根据处理措施进行相应的处理，并对处理的过程、结果进行记录与跟踪。谢谢阅读验证小组根据数据分析，做出相应的评定与结论，报请验证委员会批准。谢谢阅读8验证数据及评估验证小组对验证检测数据进行评估，并对结果进行评价结果评价：评价人：日期：9.验证报告及评审9.1验证小组依据本方案实施验证，编写验证报告。9.2验证小组组织专业人员对验证报告进行评审。9.3QA对验证报告给出结论，验证合格发放验证合格证。谢谢阅读10.再验证及周期10.1当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进精品文档放心下载行鲎试剂灵敏度的复合试验。10.2当鲎试剂、注射用水生产工艺改变或试验回家发生了任何有可能影响试验结果的感谢阅读变化时，需重新进行干扰试验。11.验证文件归档验证结束，全部验证文件（验证方案、验证报告、验证记录、验证合格证等）归档感谢阅读质量部。12.附件12.1验证小组组成及职责12.2验证前确认记录13.5验证结果评估记录...13.6验证合格证.