微生物代谢调节

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第四章微生物代谢调节

微生物的新陈代谢错综复杂，参与代谢的物质又多种多样，即使同一种物质也会有不同的代谢途径，而且各种物质的代谢之间存在着复杂的相互联系和相互影响。在长期的进化过程中，微生物建立了一套严密、精确、灵敏的代谢调节体系，能严格地控制代谢活动，使之有序而高效地运行，并能灵活地适应外界环境，最经济地利用环境中的营养物。

微生物的代谢调节具有多系统、多层次的特点。目前，人们对此了解还十分有限。第2页/共60页

了解微生物的代谢调节系统不仅有理论意义，更重要的是能有目的地改造微生物和为微生物提供最适合的环境条件，使微生物能最大限度地生产人类所需的代谢产品。第3页/共60页4.1

酶合成的调节

酶合成的调节是通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的、也是缓慢的。酶合成的调节主要有两种类型：酶的诱导和酶的阻遏。第4页/共60页4.1.1

酶的诱导(Enzymeinduction)

按照酶的合成与环境影响的不同关系，可以将酶分为两大类，一类称为组成酶(Structuralenzymes)，它们的合成与环境无关，随菌体形成而合成，是细胞固有的酶，在菌体内的含量相对稳定。如糖酵解途径(EMP)有关的酶。另一类酶称为诱导酶(Inducibleenzyme)，只有在环境中存在诱导剂(Inducer)时，它们才开始合成，一旦环境中没有了诱导剂，合成就终止。第5页/共60页诱导酶：在对数生长期的大肠杆菌(E.coli)培养基中加入乳糖，就会产生与乳糖代谢有关的ß-半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶等。这时，细胞生长速度和总的蛋白质合成速度几乎没有改变，这种环境物质促使微生物细胞中合成酶蛋白的现象称为酶的诱导。图4.1.1.培养基中加入乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成第6页/共60页4.1.2

酶合成的阻遏(Enzymerepression)

在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。合成可被阻遏的酶称为阻遏酶(repressibleenzyme)。阻遏的生理学功能是节约生物体内有限的养分和能量。酶合成的阻遏主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种类型。第7页/共60页4.1.2.1

末端代谢产物阻遏(End-productrepression)

由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的(反馈)阻遏称为末端代谢产物阻遏。通常发生在合成代谢中，特别是在氨基酸、核苷酸和维生素的合成途径中十分常见。生物合成末端产物阻遏的特点是同时阻止合成途径中所有酶的合成。第8页/共60页

对数生长期的大肠杆菌的培养基中加入精氨酸，将阻遏精氨酸合成酶系(氨甲酰基转移酶、精氨酸琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂合酶)的合成，而此时细胞生长速度和总蛋白质的合成速度几乎不变。

图4.1.4培养基中加入精氨酸阻遏精氨酸合成酶系的合成第9页/共60页若代谢途径是直线式的，末端产物阻遏情况较为简单，末端产物引起代谢途径中各种酶的合成终止。如大肠杆菌的蛋氨酸是由高丝氨酸经胱硫醚和高半胱氨酸合成的，在仅含葡萄糖和无机盐的培养基中，大肠杆菌细胞含有将高丝氨酸转化为蛋氨酸的三种酶，但当培养基中加入蛋氨酸时，这三种酶消失。图4.1.5甲硫氨酸反馈阻遏大肠杆菌的蛋氨酸合成酶的合成

(R)：表示反馈阻遏第10页/共60页

对于分支代谢途径来说，情况比较复杂。每种末端产物只专一地阻遏合成它自身那条分支途径的酶，而代谢途径分支点前的“公共酶”则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。任何一种末端产物的单独存在，都不影响酶合成，只有当所有末端产物同时存在时，才能发挥阻遏作用的现象称为多价阻遏(Multivalentrepression)。多价阻遏的典型例子是芳香族氨基酸、天冬氨酸族和丙酮氨酸族氨基酸生物合成中存在的反馈阻遏。第11页/共60页

末端代谢产物阻遏在微生物代谢调节中有着重要的作用，它保证了细胞内各种物质维持适当的浓度。当微生物已合成了足量的产物，或外界加入该物质后，就停止有关酶的合成。而缺乏该物质时，又开始合成有关的酶。

末端代谢产物阻遏的机制也可以用操纵子学说解释。第12页/共60页

4.1.2.2

分解代谢物阻遏(Cataboliterepression)

当细胞内同时存在两种可利用底物(碳源或氮源)时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。现在知道，这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏。第13页/共60页

分解代谢物阻遏过去被称为葡萄糖效应。图4.1.7培养基中不同糖对大肠杆菌生长速度的影响

1.单独加入葡萄糖时，菌体生长几乎没有延迟期；单独加入乳糖时，菌体生长有明显的延迟期；2.同时加入葡萄糖和乳糖时，菌体呈二次生长第14页/共60页

酶的诱导、分解代谢物阻遏和末端产物阻遏可以同时发生在同一微生物体内。这样，当某些底物存在时微生物内就会合成诱导酶，几种底物同时存在时，优先利用能被快速或容易代谢的底物；而与代谢较慢的底物有关酶的合成将被阻遏；当末端代谢产物能满足微生物生长需要时，与代谢有关酶的合成又被终止。第15页/共60页4.2

酶活性的调节

通过改变酶分子的活性来调节代谢速度的调节方式称为酶活性的调节。与酶合成调节方式相比，这种调节方式更直接，并且见效快。是发生在蛋白质水平上的调节。第16页/共60页

某些酶的活性受到底物或产物或其结构类似物的影响，这些酶称为调节酶(Regulatoryenzyme)。这种影响可以是激活、也可以是抑制酶的活性。我们把底物对酶的影响称为前馈，产物对酶的影响称为反馈。前馈作用一般是激活酶的活性。在分解代谢中，后面的反应可被较前面反应的中间产物所促进，如粪链球菌(Streptococcusfeacalis)的乳酸脱氢酶活性可被1,6-二磷酸果糖所激活；又如在粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)培养时，柠檬酸会促进异柠檬酸脱氢酶活性。第17页/共60页

调节酶通常是变构酶，一般具有多个亚基，包括催化亚基和调节亚基。变构酶的激活和抑制过程。激活过程的效应物称为激活剂(activator)，而抑制过程的效应物称为抑制剂(inhibitor)。

图4.2.2变构酶受效应物的调节过程

1.激活剂激活无活性的酶；2.抑制剂抑制有活性的酶第18页/共60页

在微生物代谢调节中更常见的是反馈调节，尤其是末端产物对酶活的反馈抑制。抑制剂与调节亚基结合引起酶构象发生变化，使催化亚基的活性中心不再能与底物结合，酶的催化性能随之消失。调节酶的抑制剂通常是代谢终产物或其结构类似物，作用是抑制酶的活性。效应物的作用是可逆的，一旦效应物浓度降低，酶活性就会恢复。调节酶常常是催化分支代谢途径一系列反应中第一个反应的酶，这样就避免了不必要的能量浪费。第19页/共60页

4.3

微生物代谢调节的模式

在微生物合成代谢过程中，反馈阻遏和反馈抑制往往共同对代谢起着调节作用，它们通过对酶的合成和酶的活性进行调节，使细胞内各种代谢物浓度保持在适当的水平。反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢，反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系列反应的多个酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。第20页/共60页反馈阻遏（feedbackrepression）与反馈抑制（feedbackinhibition）的性质比较反馈阻遏反馈抑制调控对象酶的合成酶的活性调控开关终产物浓度终产物浓度调控的水平DNA-mRNA-酶蛋白（转录水平）酶蛋白的构象变化调控方式终产物与阻遏蛋白亲和力终产物与变构部位亲和力调控动作阻遏蛋白与操纵基因结合，不能合成mRNA通过变构效应，酶的构象变化对酶的影响影响催化一系列反应的多个酶只对是一系列反应中的第一个酶起作用形成的控制开、关控制控制酶活性大小调控反应速度迟缓迅速第21页/共60页4.3.1

直线式代谢途径的反馈控制

对于只有一个末端代谢产物的途径，即直线式代谢途径，当末端代谢产物达到一定浓度时，就会反馈控制该代谢途径。末端产物的反馈阻遏一般是阻止该途径中所有酶的合成，末端产物抑制一般是抑制该途径第一个酶的活性。

图4.3.1直线式末端产物反馈控制第22页/共60页

在研究大肠杆菌的异亮氨酸合成途径时，首先发现了直线式代谢途径的反馈抑制。苏氨酸是合成异亮氨酸的前体，在培养基中给苏氨酸缺陷型大肠杆菌补充苏氨酸时，该菌株可以合成异亮氨酸，但若同时在培养基中添加异亮氨酸，就不能利用苏氨酸合成异亮氨酸了。这是因为异亮氨酸抑制了由苏氨酸转化为异亮氨酸途径的第一个酶，即L-苏氨酸脱氨酶.图4.3.2异亮氨酸合成途径中的直线式反馈抑制第23页/共60页

大肠杆菌中由氨甲酰磷酸和天门冬氨酸合成胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)时需要七种酶，当CTP达到一定浓度后，便反馈抑制催化第一个反应的酶，即天门冬氨酸转氨甲酰酶。图4.3.3大肠杆菌CTP合成途径中的直线式反馈抑制第24页/共60页

反馈阻遏还有另一种形式，即末端产物阻遏与中间产物诱导的混合形式。如图所示，末端产物D的积累会阻遏该途径中第一个酶的合成。当末端产物D浓度下降时，第一个酶恢复合成，从而导致中间产物B在胞内累积。B浓度的增高，又诱导第二、三个酶的合成，使途径逐渐畅通。当D浓度上升到一定值时，第一个酶的合成受阻，B浓度下降，不再诱导第二、三个酶的合成，该途径逐渐阻塞。图4.3.4末端产物阻遏和中间产物诱导的混合控制第25页/共60页

4.3.2

分支代谢途径的反馈控制

由几种末端代谢产物共同对生物合成途径进行控制的体系较为复杂。即便是同一代谢途径，不同菌种也会有不同的控制模式。这些控制可以是反馈阻遏或反馈抑制单独作用的结果，也可以是两者共同作用的结果。第26页/共60页4.3.2.1

协同或多价反馈控制(Concertedormultivalentfeedbackcontrol)

分支代谢途径的几个末端产物同时过量时，该途径的第一个酶才会受到反馈阻遏或反馈抑制。如多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)在合成天门冬氨酸族氨基酸时，天门冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。如果仅是苏氨酸或赖氨酸过量，并不能引起抑制作用。

图4.3.5末端产物D和F协同反馈控制模式第27页/共60页4.3.2.2

合作反馈控制(Coopreativefeedbackcontrol)

这类控制体系与协同反馈控制类似，但是该体系中的末端产物都有较弱的独立控制作用。当所有的末端产物同时过剩时，会导致增效的阻遏或抑制，即其阻遏或抑制的程度比这些末端产物各自独立过量时的总和还要大，因此，又称为增效反馈控制(Synergisticfeedbackcontrol)。当只有一个末端产物(图中的D)过量时，紧接着分支点(图中的B)后的反馈控制立即起作用，限制该末端产物的合成，代谢将转向细胞需要合成的其它产物继续进行(图中的F)。图4.3.6末端产物D和F合作反馈控制模式第28页/共60页4.3.2.3

累积反馈控制(Cumulativefeedbackcontrol)

每个分支途径的末端产物都独立于其它末端产物，以一定百分比控制该途径第一个共同的酶所催化的反应。当几个末端产物同时存在时，它们对酶反应的抑制是累积的，各末端产物之间既无协同效应，也无拮抗作用。如图所示，D和F分别独立地抑制第一个酶活性的30%和40%，那么，当D和F均过量时，它们对第一个酶的总抑制是58%，即100%-(100%-30%)×(100%-40%)=58%。与合作反馈控制的情况相似，每个末端产物肯定会对紧接分支点B后的反应施加控制，以使共同的中间产物B不再用于已过量的产物合成。

图4.3.7末端产物D和F的累积反馈控制模式第29页/共60页

累积反馈抑制最早在大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶调节中发现。该酶受8个最终产物的累积反馈抑制，只有当它们同时存在时，酶活性才会被完全抑制。如色氨酸单独存在时，可抑制酶活性的16%，CTP为14%，氨基甲酰磷酸为13%，AMP为41%，这4种产物同时过量时，酶活性被抑制63%。所剩的37%酶活性则受到其它四种产物---组氨酸、丙氨酸、葡萄糖磷酸和甘氨酸的累积抑制。图4.3.8谷氨酰胺合成酶的累积反馈抑制第30页/共60页4.3.2.4

顺序反馈控制(Sequentialfeedbackcontrol)

在顺序反馈控制体系中，直接对第一个共同的酶起控制作用的并不是末端产物，而是分支点上的中间产物。每个末端产物均对紧接分支点B后导向各自分支途径的酶进行控制，D抑制B向C反应，F抑制B向E反应，D、F单独或两者共同的抑制作用将导致B的积累，过量的B又会抑制A向B反应。

图4.3.9顺序反馈控制的模式第31页/共60页

顺序反馈控制存在于枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成。图4.3.10枯草杆菌芳香族氨基酸合成途径中的顺序反馈抑制第32页/共60页4.3.2.5

同工酶控制(Isoenzymecontrol)

如果代谢途径中某一反应受到一组同工酶的催化，那么不同的同工酶可能受各不相同的末端产物控制。如果紧接分支点后的酶受其对应的末端产物控制，那么，同工酶控制体系将更有效。如图所示，从A到B反应由同工酶a和b催化，当末端产物F过量时，受F控制的从A到B的同工酶b和从B到E的酶被抑制，而同工酶a不受影响，使A能顺利合成D，因此，F的过量不会干扰D的合成。同样道理，D的过量也不会干扰F的合成。图4.3.12末端代谢产物D和F的同工酶控制模式第33页/共60页

大肠杆菌有三个天门冬氨酸激酶和两个高丝氨酸脱氢酶参与催化赖氨酸和苏氨酸的合成。天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ可被苏氨酸抑制和阻遏，高丝氨酸脱氢酶Ⅱ可被甲硫氨酸阻遏，天冬氨酸激酶Ⅲ可被赖氨酸抑制和阻遏，见图。图4.3.13大肠杆菌合成苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸中的同工酶调节

E表示末端产物反馈抑制；R表示末端产物反馈阻遏第34页/共60页4.4

代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用

工业发酵的目的就是大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。在正常生理条件下,微生物总是通过其代谢调节系统最经济地吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物。人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，这就是所谓代谢的人工控制。虽然微生物代谢调节的理论目前还有很大的局限性，但它已在微生物育种和发酵工艺的优化中发挥了重要的作用。随着代谢调节理论的不断充实和完善，代谢的人工控制将对发酵工业发挥更加重要的作用。目前，人工控制代谢主要是通过遗传学和生物化学方法来实现的。第35页/共60页4.4.1

遗传学的方法

通过改变微生物遗传物质可以从根本上打破微生物原有的代谢控制机制，具体包括应用特定的营养缺陷型突变株和抗反馈调节的突变株的选育。第36页/共60页4.4.1.1

营养缺陷型突变株的应用

在一定的培养条件下，营养缺陷型突变株可以积累相当高浓度的中间代谢产物或末端代谢产物。对于直线式代谢途径，选育末端代谢产物营养缺陷型的突变株只能积累中间代谢产物.

如末端产物E对途径第一个酶有反馈阻遏或反馈抑制，而菌株失去了将C转化成D的能力，是E的营养缺陷型。假如在培养基中限量添加E，菌体得以生长，中间产物C能够大量积累。枯草芽孢杆菌的精氨酸缺陷型就是一个典型例子,鸟氨酸积累量可达到25克/升。第37页/共60页

对于分支代谢途径而言，情况比较复杂。如图所示，分支途径因E和G对途径第一个酶有协同反馈控制，而突变株失去了将C转变成D的能力，产物E无法正常生成,从而解除了E和G的协同反馈控制。若培养基中限量补充E，由于末端产物G对C到F反应的控制，就会造成中间产物C的积累；第38页/共60页突变株是E和G双重缺陷型，因而需限量添加E和G第39页/共60页

突变株失去了从F转变成G的能力，在限量补充E和G的情况下，可以积累F第40页/共60页

末端产物E和I对途径第一个酶有协同反馈控制作用，突变株失去了将C转变成F的能力，所以，它也是双重营养缺陷菌株。如果培养基中限量添加G和I，可以积累末端产物E.第41页/共60页

在代谢途径中，一方面由于赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸激酶有合作反馈抑制作用，另一方面，天冬氨酸除合成赖氨酸外，还作为合成苏氨酸和蛋氨酸的原料。因此，正常的细胞内难以积累较高浓度的赖氨酸。为了解除正常的调节以获得赖氨酸的高产菌株，有人选育谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的高丝氨酸缺陷型作为赖氨酸的发酵菌种。该菌种由于不能合成高丝氨酸脱氢酶(HSDH)，故不能合成高丝氨酸，也不能合成苏氨酸和蛋氨酸，在补充适量高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)条件下，菌株能大量产生赖氨酸图4.4.2谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产E：表示反馈抑制；R：表示反馈阻遏第42页/共60页

肌苷酸是重要的呈味核苷酸，它是嘌呤核苷酸生物合成途径中的一个中间代谢产物。选育在肌苷酸转化成腺苷酸或鸟苷酸的几步反应中的营养缺陷型菌株，才能积累肌苷酸。如腺苷酸琥珀酸合成酶缺失的腺嘌呤缺陷型在少量添加腺苷酸的培养基中能正常生长并积累肌苷酸。图4.4.3肌苷酸合成途径的代谢调节(R)：表示反馈抑制；(1)：5-磷酸核糖焦磷酸激酶；(2)：5-磷酸核糖焦磷酸转胺酶；(12)：腺苷酸琥珀酸合成酶；(13)：腺苷酸琥珀酸分解酶；(14)：肌苷酸脱氢酶；(15)：黄苷酸转胺酶第43页/共60页

次级代谢产物青霉素与初级代谢产物赖氨酸是同一分支代谢途径的两个产物。它们的共同前体是α-氨基戊二酸。赖氨酸对合成α-氨基戊二酸的酶有反馈阻遏或抑制作用，当赖氨酸达到一定浓度后，便阻止α-氨基戊二酸的合成，也阻止了青霉素的合成。选育赖氨酸营养缺陷型，就可解除赖氨酸反馈调节，同时，也切断了通向赖氨酸的代谢支路，使大量生成的α-氨基戊二酸用于青霉素的合成。图4.4.4.青霉菌(Penicillumchrysogonum)合成赖氨酸和青霉素中的反馈抑制,(E)：表示反馈抑制第44页/共60页

4.4.1.2

抗反馈控制突变株的应用

抗反馈控制突变株就是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼而有之的菌株。在这类菌株中，反馈调节已经解除，所以能大量积累末端代谢产物。抗反馈抑制突变株可以从结构类似物抗性突变株和营养缺陷型回复突变株中获得。第45页/共60页

添加了结构类似物的培养基就象一个筛子，可以将解除了反馈控制的突变株筛选出来。这些与末端代谢产物结构类似的化合物会干扰正常菌体的代谢，甚至引起菌体死亡，所以又称为抗代谢物。第46页/共60页以氨基酸代谢为例：正常情况下，代谢末端产物氨基酸A是菌体蛋白的必需组成成分，它能反馈阻遏或抑制合成它的有关酶。它的结构类似物A’在空间结构上与之相似，也能象A一样与原阻遏物或调节酶的调节亚基结合，从而发生阻遏或抑制作用。但A’不能正常参与蛋白质的合成，或只能合成无活性的蛋白质。第47页/共60页

当结构类似物A’达到一定浓度后，一方面A’能起反馈控制作用，阻止A的正常合成，另一方面A’又无法代替A参与正常蛋白质的合成，从而造成正常的细胞因缺乏A而饥饿死亡。但如果突变株解除了反馈控制，即末端产物氨基酸A无法与原阻遏物或调节亚基结合，那么A’也就无法起反馈调节作用，A’的毒害作用就表现不出来。我们说该菌株对A’有抗性而得以生存下来。根据以上原理，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可能得到解除了反馈调节的突变株。结构类似物抗性菌株不一定都是解除反馈调节的菌株。第48页/共60页

许多氨基酸、嘌呤、嘧啶和维生素的结构类似物已用于氨基酸、核苷、核苷酸和维生素高产菌株的育种工作。

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从营养缺陷型回复突变株也有可能获得解除反馈调节的菌株。调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：

1.催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；

2.一种可能仅仅是催化亚基发生突变。如果前者发生回复突变，则又有两种可能性，一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平,另一种可能是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。因此，可以用营养缺陷型回复突变的方法，从营养缺陷型回复突变株中获得对途径调节酶解除了反馈调节的突变株。第50页/共60页4.4.1.3增加结构基因数目

增加发酵产品的结构基因数目当然可以提高发酵产物的产量。现代基因操作技术完全可以担此重任。如大肠杆菌引入一个携带ß-半乳糖苷酶的质粒后，可以增加3倍的ß-半乳糖苷酶产量。

携带细菌结构基因的转导噬菌体溶源化大肠杆菌后，该原噬菌体可被诱导复制，噬菌体复制结果是在每个细胞中增加许多基因数目，这些基因编码的酶就可大量合成。第51页/共60页4.4.2

生物化学方法

4.4.2.1

添加前体绕过反馈控制点

不通过遗传学方法也能改变菌株的调节机制，采取添加前体绕过反馈调节点是一种有效的方法，能使某种代谢产物大量积累。如图，在发酵培养基中添加C，可以大量积累D。其原因是D的前体C来自外源，并不会因为D的积累而有很大的波动。由于F对从C到E的反应有反馈调节，所以，只有少部分的C用于合成F，大部分外源的C用于合成D。

图4.4.5

添加前体绕过反馈调节点第52页/共60页4.4.2.2

添加诱导剂

诱导酶只有在诱导剂存在时才形成，因此，在培养基中加入诱导剂，可以大量合成这类酶。从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，如大肠杆菌ß-半