微生物代谢调节和代谢工程新

微生物代谢调节和代谢工程新第1页/共69页

微生物的生长过程中机体内的复杂代谢过程是相互协调和高度有序的，并对外环境的改变能迅速作出适应反应。

我们的目的：让微生物建立新的代谢方式，高浓度的积累人们所期望的产品。

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代谢调节代谢工程第3页/共69页代谢调节1、微生物的代谢类型和自我调节2、酶活性调节3、酶合成调节4、分支生物合成途径调节5、能荷调节6、代谢调控（人为）7、次级代谢与次级代谢调节第4页/共69页微生物的自我调节

微生物体内物质的合成和降解是由其自我调控的。在单一有机化合物碳源的培养基中，大分子合成途径中各个环节配合的很好，效率高。存在多种不同的碳源时，细胞会优先吸收某一碳源，在体内合成大量与代谢相关的酶类。第5页/共69页分解途径合成代谢葡萄糖合成培养基中葡萄糖培养基中甘露糖抑制？阻遏？第6页/共69页自我调节的部位膜系统的选择性吸收。核内相关基因的调控表达。酶系在细胞基质内被分隔。第7页/共69页酶活性的调节调节的是已有酶的活性，是在酶化学水平上发生的调节。包括酶活性的激活和抑制两个方面。酶合成的调节调节的是酶分子的合成量，是在遗传水平上发生的调节包括酶合成的诱导和阻遏二种水平上的重要的两种方式：反馈抑制和反馈阻遏第8页/共69页酶活性调节酶的激活作用酶的抑制作用第9页/共69页酶活性的调节机制——别构调节（变构调节）别构效应：底物或底物以外的物质和别构酶分子上的相应部位可逆地非共价结合后，通过酶分子构象的变化影响酶的催化活性，这种效应称为别构效应别构效应剂：引起别构效应的物质称为效应物别构激活剂：凡是和酶分子结合后使酶反应速度加快的别构效应剂就称为别构激活剂（正效应剂）别构抑制剂：（负效应剂）

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别构酶：具有别构效应的酶称之为别构酶别构酶通常能对反应起调节作用，是调节酶的一种。第11页/共69页别构酶举例——大肠杆菌（E.coli）天冬氨酸转氨甲酰酶（简称ATCase）

ATCase有二个底物和CTP、ATP二个别构效应剂——Asp、ATP是别构激活剂，CTP是别构抑制剂第12页/共69页ATCase（天冬氨酸转氨甲酰酶）ATCase的相对分子质量是310000，由12条多肽链组成每个调节亚基上有两个别构效应剂（CTP、ATP）的结合部位完整有活性的酶催化亚基（三聚体）调节亚基（二聚体）第13页/共69页酶合成的调节诱导和阻遏诱导：某种化合物作用下，导致某种酶合成或合成速率提高的现象。阻遏：某种化合物作用下，导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。第14页/共69页酶合成的诱导作用

组成酶：不依赖于酶底物或底物的结构类似物的存在二合成的酶。诱导酶：依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。

第15页/共69页酶合成的阻遏酶合成的阻遏：在微生物代谢中，胞内某种产物的积累造成该产物合成途径中前面某种酶的合成受到阻碍。末端产物阻遏：如果代谢产物是合成途径的终产物，则为末端产物阻遏。分解代谢产物阻遏：如果代谢产物是某种化合物分解的中间产物，则为分解代谢产物阻遏。葡萄糖效应第16页/共69页酶合成的机制乳糖操纵子模型诱导和阻遏第17页/共69页分支生物合成途径的调节同工酶调节协同反馈抑制增效（合作）反馈抑制累积反馈抑制顺序反馈抑制联合激活或抑制调节酶的共价修饰第18页/共69页天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛赖氨酸苏氨酸甲硫氨酸高丝氨酸AKHSDHAK：天冬氨酸激酶；HSDH：天冬氨酸脱氢酶第19页/共69页分支生物合成途径的调节同工酶：E.coli天冬氨酸族氨基酸合成，天冬氨酸激酶I、II、III。协同反馈调节：一种酶受到反馈调节，但需要一种以上终产物过量累加反馈调节：多个末端产物抑制第一个酶，单独只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的增效反馈调节：多个末端产物抑制第一个酶，多个末端产物抑制第一个酶，单独只能部分抑制或阻遏，总的效果是增效的第20页/共69页分支生物合成途径的调节顺序反馈调节：依次反馈调节联合激活或抑制调节：一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢效率。如：肠细菌氨甲酰磷酸合成酶的联合激活和抑制调节

第21页/共69页分支生物合成途径的调节酶的共价修饰大肠杆菌谷胺酰胺合成酶由于共价修饰引起活力的改变有无腺苷酰基第22页/共69页中间产物UVW末端产物tuvw反馈抑制末端产物直线式抑制ABCDEFGHabc同工酶调节第23页/共69页能荷代谢

能荷：细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应功能的高能磷酸键的量度。表示式：P64（35）大肠杆菌的能荷在生长期间为0.8，静止期为0.5。

第24页/共69页代谢调控在人为条件的控制下，可以使微生物过量产生各级初级代谢产物和次级代谢产物。一般可以根据代谢调节理论，通过改变发酵工艺条件如pH、温度、通气量、培养基的组成和微生物遗传特性等，达到改变菌体内的代谢平衡，过量产生所需要产物的目的。第25页/共69页代谢调控发酵条件的控制改变细胞的透性菌种遗传特性的改变第26页/共69页在生产中，如果发酵的条件不同，可能生成的主要产物也不同。控制不同的发酵条件，影响微生物的代谢调节系统，使其体内代谢按人们设想的方向进行。(一）发酵条件的控制第27页/共69页1.以谷氨酸生产工艺为例

—各种发酵条件改变的影响

工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。

1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。第28页/共69页产生菌株特点：革兰氏阳性不形成芽胞没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸。第29页/共69页谷氨酸生物合成机理：由三羧酸循环中产生的α-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。第30页/共69页ProductionProcessofL-GlutamicacidSketchofmainreactioninCorynebacteriumglutamicumConnectedwiththecitricacidcycly第31页/共69页不通发酵条件对谷氨酸产生菌代谢方向的影响发酵条件代谢方向

通气乳酸或琥珀酸谷氨酸NH4+a-酮戊二酸谷氨酸谷氨酰胺生物素乳酸或琥珀酸谷氨酸适量适量适量不足不足不足不足适量第32页/共69页2．添加生物合成的前体合成途径中增加其中一个前体的量，可以大幅度提高发酵产量。前体：某些化合物在加入培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大变化，这类小分子物质称为前体。第33页/共69页PEP色氨酸合成途径邻氨基苯甲酸色氨酸邻氨基苯甲酸反馈抑制3-脱氧-2-酮-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-P4-P-赤藓糖第34页/共69页3、其他条件的控制使用诱导物----

生产相关酶类时，可以加入相应的底物作为诱导物，可以有效增加这些酶的产量。培养基成分和浓度的控制-----

尽量避免由于培养基的不当使用引起的分解代谢阻遏。在发酵培养基中通常采用适量的速效和迟效碳源、氮源的配比。第35页/共69页（二）改变细胞透性

发酵过程中，可以控制使用那些影响细胞膜通透性的物质作为培养基的成分，有利于代谢产物分泌出来，从而避免了末端产物的反馈抑制调节。第36页/共69页1.通过生理学手段控制细胞膜渗透性2.通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性生物素谷氨酸细胞膜渗透性青霉素谷氨酸油酸缺陷型油酸第37页/共69页（三）菌种遗传特性的改变

改变微生物的遗传特性，即改变酶的活性或酶的合成系统，使之对反馈调节不敏感，达到过量生产代谢产物的目的。用于这样生产的菌株多为抗反馈调节突变株和营养缺陷型菌株。第38页/共69页天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛赖氨酸苏氨酸甲硫氨酸高丝氨酸AKHSDH第39页/共69页应用抗反馈调节突变株解除反馈调节抗反馈调节突变株：对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性或兼而有之的菌株。反馈抑制或阻遏或两者解除。第40页/共69页分解途径合成代谢苏氨酸合成培养基中苏氨酸类似物抑制或阻遏解除第41页/共69页

利用营养缺陷型突变株生产的氨基酸产物菌株营养缺陷型基质效价（g/L）

L-瓜氨酸枯草杆菌精氨酸葡萄糖16L-赖氨酸谷氨酸棒状杆菌苏氨酸，蛋氨酸葡萄糖50L-尿氨酸谷氨酸棒状杆菌精氨酸葡萄糖

25L-苯丙氨酸石蜡棒状杆菌酪氨酸正烷烃15L-苏氨酸大肠杆菌Lys,Met,ILe葡萄糖20第42页/共69页工业上利用抗反馈调节突变株生产的氨基酸产物菌株所抗结构类似物L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌D-精氨酸L-组氨酸谷氨酸棒状杆菌三唑丙氨酸L-异亮氨酸短杆菌α-氨基-β-羟基戊酸L-苏氨酸短杆菌α-氨基-β-羟基戊酸第43页/共69页次级代谢与次级代谢调节初级代谢和次级代谢次级代谢的调节类型第44页/共69页（一）初级代谢和次级代谢初级代谢：普遍存在于生物中的代谢类型，微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所必需的物质和能量的过程，称为初级代谢。。初级代谢产物：单糖、核苷酸、脂肪酸等单体，以及由他们组成的各种大分子聚合物如蛋白质、核酸等，是有机体生存必不可少的物质。第45页/共69页次级代谢：某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型。次级代谢产物：在次级代谢途径中合成的产物，不是微生物生长所必需的，种类很多，如氨基糖衍生物等。第46页/共69页

次级代谢不同于初级代谢。初级代谢自始至终贯穿于细胞的生活周期中，对外界环境变化敏感性小，其合成酶专一性强。而次级代谢仅在细胞体生长的某个阶段产生，对外界环境变化敏感，合成酶专一性不强。

现代抗生素的定义:由某些微生物产生的化学物质,能抑制微生物和其他细胞增殖的物质叫做抗生素。

第47页/共69页第48页/共69页（二）次级代谢的调节类型总体类型包括：酶的合成诱导和阻遏酶活性的激活和抑制细分类型包括：氮分解产物调节、碳分解产物调节和磷酸盐调节等等。第49页/共69页反馈调节1、次级代谢产物的自身反馈调节，包括反馈抑制和反馈阻遏。第50页/共69页2、分解代谢产物调节碳的分解产物和氮的分解产物反馈调节作用存在于次级代谢中。如葡萄糖抑制发酵中青霉素、春日霉素、吲哚霉素、放线菌素等抗生素的合成。链霉素产生菌培养中，铵盐作唯一氮源时，可对链霉素合成产生抑制作用。第51页/共69页3、初级代谢产物的调节

3.1初级代谢产物和次级代谢产物的合成之间有一条共同的合成途径，当初级代谢产物积累时，反馈抑制了某一步反应的进行，而最终抑制了次级代谢产物的合成。第52页/共69页α-酮戊二酸青霉素合成途径调节高柠檬酸合成酶δ-腺苷酸-α-氨基己二酸α-o氨基己二酸反馈抑制高柠檬酸乙酰CoA青霉素Gδ-（α-氨基己二酸酰）

-L-半胱氨酸赖氨酸反馈阻遏第53页/共69页3.2初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成，当初级代谢产物积累，反馈抑制自身的合成，同时也影响了次级代谢产物的合成。第54页/共69页

4．磷酸盐的调节磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。其机制按效应剂说有直接作用，即磷酸盐自身影响抗生素合成，可能通过抑制相关酶的活性。间接作用，即磷酸盐调节胞内其他效应剂(如ATP、腺苷酸能量负荷和cAMP)，进而影响抗生素合成。已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯等32种抗生素的合成产生阻抑作用。第55页/共69页

利用基因工程技术，定向改造细胞代谢途径，并与基因调控、代谢调控相结合，构建新的代谢途径

包括三种代谢工程设计方法：改变代谢途径扩展代谢途径构建新的代谢途径代谢工程概述第56页/共69页ACBDF加速代谢旁路缺失E扩展途径G新途径H三种方法的简易图示第57页/共69页（一）改变代谢途径改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢途径的合成，提高目的产物。第58页/共69页1.加速限速反应（以头孢霉素C为例）青霉素N是头胞霉素合成的中间体用顶头孢发酵时发现青霉素N的积累下一步酶反应是头胞霉素合成的限速步骤乙酰氧基头胞霉素C合成酶克隆了这个酶的基因（cefEF），并转化到顶头孢中转化子头胞霉素C产量提高了ACB加速第59页/共69页2.改变分支代谢流向提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占优势在lys合成中，选育出解除了反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了lys产量ABD缺失第60页/共69页天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛赖氨酸苏氨酸甲硫氨酸高丝氨酸AKHSDH第61页/共69页3.构建代谢旁路大肠杆菌