第十二章 抗寄生虫免疫

第三十七章抗寄生虫免疫（ImmunitytoParasite）一、概述长期以来，由寄生虫（包括原虫、蠕虫、昆虫）所引起的寄生虫病一直是危害人类及动物健康的重要疫病之一。这些寄生虫，有的感染人（如恶性疟原虫），有的感染动物（如伊氏锥虫），有的为人兽共同感染（如旋毛虫），它们或引起宿主的急性死亡（如恶性疟原虫、伊氏锥虫），或在宿主体内长期处于亚临床感染状态，逐渐降低宿主的抵抗力（如各种肠道寄生虫）。由于寄生虫属于真核生物，如蠕虫和节肢昆虫都为多细胞寄生动物，虫体的各种功能器官逐渐趋于完善，虫体细胞内具有完整的细胞核和细胞器结构，即使单细胞原虫，其细胞核内的核酸组成及细胞器结构都较细菌等原核生物复杂，因而寄生虫对宿主及环境条件的适应能力较原核生物更强。从这种意义上讲，人类在疫病的控制方面，对寄生虫病的防治比对传染病的防治要更艰难。有关寄生虫病的防治策略，国内外学术界一直存在两种观点，一种认为应以药物防治为主，理由是寄生虫抗原成分复杂，制苗不易，而且效果不佳；另一种认为应以免疫预防为主，理由是寄生虫与细菌、病毒一样，也有其自身的抗原或特异抗原，也应能够刺激机体产生保护性免疫应答。不论哪一种观点都有其一定的道理和成功的例证。在20世纪80年代以前，人们对寄生虫病的免疫预防多持谨慎态度。虽然，各国一直没有放松对寄生虫病的免疫学研究，但多数人更倾向于药物防治的重要性。事实上，在虫苗没有成功之前，有效的药物治疗也确实起到了十分重要的作用。但近几年来，人们逐渐发现，原来经典的抗寄生虫药（如氯喹、氯苯胍等）对一些寄生虫病的治疗作用不断减弱，在有些地区（如在非洲）几乎完全失去使用价值，即寄生虫对传统药物已经产生了耐药性。面对这一局面，人们又把目光重新转移到了免疫学预防方面。免疫预防较药物预防有很多的优越性，其一是它防病于未然；其二是副作用不明显。而药物防治有其不可克服的弱点，一是对耐药性虫株无能为力；二是有一定的副作用；三是研制周期可能很长。目前，随着各种生物学新技术，尤其是分子生物学技术在寄生虫学研究领域的应用，寄生虫免疫学研究也不断取得进展，各种虫体的抗原变异机理不断被揭示，保护性抗原分离及分子克隆不断取得突破，寄生虫基因工程虫苗已初露倪端，牛巴贝斯虫基因工程苗在澳大利亚已开始进行田间试验，人用恶性疟原虫基因工程苗已在坦桑尼亚等非洲国家试用了多年，并取得了令人振奋的临床保护效果。基因免疫研究也取得可喜进展。相信随着寄生虫免疫学研究的不断深入，会有更多的寄生虫虫苗问世。本章主要就寄生虫免疫学的有关内容作一介绍。二、抗寄生虫感染的免疫特点宿主对寄生虫的免疫表现为免疫系统对寄生虫的识别与清除，包括天然非特异性免疫和生后获得的特异性免疫两个方面。宿主对寄生虫的天然非特异性免疫包括吞噬细胞的吞噬作用、炎症反应或由炎症反应包围寄生虫而形成的包囊。而生后特异性免疫则包括宿主对寄生虫的特异识别能力，即免疫系统与寄生虫抗原性物质相互作用的全过程并产生记忆反应。宿主对寄生虫的免疫，常是非特异免疫和特异免疫二者协同作用的结果。（一）抗寄生虫感染的免疫类型消除性免疫（sterilizingimmunity） 即免疫机体能够完全消除侵入体内的虫体。这种免疫在临床上很少见，如感染皮肤型利什曼病的人或犬，病愈后，对再次感染可产生完全的免疫力。接种泰勒虫苗的牛在一定时间内也可产生消除性的免疫力。提高人和动物产生抗寄生虫消除性免疫力是寄生虫工作者的主要目标。非消除性免疫（nonsterilizingimmunity） 这是寄生虫感染中常见的一种免疫状态。宿主不能完全消除侵入体内的虫体，那些在体内寄生的少数虫体对宿主也不会产生严重损害，而起到免疫作用，不断刺激机体产生对再感染的免疫力，即所谓的带虫免疫（premunition），早期的牛巴贝斯虫苗就是根据这一理论制备的。将体内有巴贝斯虫寄生而临床上又不表现任何症状的牛的血液接种其他的牛，使后者也处于带虫免疫状态；或是用药物杀死发病牛体内的绝大部分虫体，而保留一部分虫体，使宿主处于带虫免疫状态。但后来发现这两种方法均不可靠，前者有大面积传播疾病的可能性，而后者易造成耐药性虫株产生。缺少有效的获得性免疫这一点在蠕虫感染中比较常见，一般宿主对消化道内的蠕虫的免疫反应都很有限，很难有效地清除虫体。另外，一些寄生在免疫细胞内的虫体（如利什曼原虫、弓形虫等）也能有效地逃避宿主的免疫清除。（二）抗寄生虫感染的免疫机制宿主对寄生虫感染所产生的获得性免疫包括体液免疫和细胞免疫。在多数情况下，两种免疫效应相互协同作用，并有其他细胞（如巨噬细胞、肥大细胞等）的参与。不同的虫体所诱导的免疫反应不同。一般单细胞原虫，尤其是血液内寄生原虫（如巴贝斯虫、疟原虫、锥虫）主要激发宿主的体液免疫应答，即由特异抗体（主要为IgG）介导抗寄生虫免疫应答。抗体可以与虫体表面的特异受体结合，以阻止虫体对宿主细胞的识别和侵入，进而在补体或其他吞噬细胞的作用下，将虫体清除。抗体也可以与感染有虫体的细胞结合，通过特异性的ADCC作用，杀死细胞内寄生的虫体。宿主对消化道内寄生的虫体的免疫反应则比较复杂。其体液免疫主要以IgE和IgA的作用为主，而嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞也发挥非常重要的抗虫作用。蠕虫本身作为变应原可刺激宿主产生大量IgE抗体。在肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面都有与IgE结合的Fc受体。当IgE与寄生虫抗原结合时，可诱发这些细胞脱颗粒，释放组织胺等活性物质，从而引起超敏反应。这在蠕虫感染是比较常见的现象，特别是在胃肠道线虫感染时，这种超敏反应是导致虫体排出的原因之一。蠕虫感染过程中嗜酸性粒细胞增多也是一种免疫相关现象。蠕虫本身可产生嗜酸性粒细胞趋化因子（eosinophilchemotacticfactor，ECF），嗜酸性粒细胞受ECF作用，移向寄生虫的寄生部位，与虫体上的抗体Fc片段结合，释放O2及磷酸脂酶等物质，参与对虫体的损伤过程。三、寄生虫的抗原组成在寄生虫与宿主的相互关系中，寄生虫抗原诱导宿主产生免疫应答，尤其是那些存在于寄生虫体表及其分泌物/排泄物内的抗原，与宿主的免疫细胞直接接触，具有重要的免疫原性，是制备虫苗的主要抗原。寄生虫抗原的化学构成包括多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白及脂多糖等。在同一虫种的不同发育时期之间，可存在共同抗原和期特异性抗原；在不同虫种之间甚至在同种不同株之间，以及在寄生虫与宿主之间也可存在共同抗原和特异抗原。近年来，随着生物化学、分子生物学、免疫学和杂交瘤等技术用于寄生虫抗原的研究，寄生虫抗原的分离、纯化、特性鉴定等方面都有了很快的进展，并已经进入了分子水平。在了解寄生虫与宿主之间的相互关系与寄生虫的致病作用、诊断寄生虫病、研制虫苗，尤其是分子虫苗方面，对寄生虫抗原的研究已处于重要的关键地位。来源和组织定位上分，寄生虫抗原可分为：①可溶性外抗原，它是从活的寄生虫或寄生虫培养细胞内释放的抗原，也就是寄生虫分泌（escretion）/排泄（secretion）抗原（ES抗原），一般认为，这部分抗原的免疫原性最强，目前广泛应用的犬巴贝斯虫虫苗和牛巴贝斯虫（包括双芽巴贝斯虫）虫苗都是以从虫体的培养上清中分离的抗原制备而成；②可溶性体抗原，它是来自寄生虫或被寄生细胞浸出的表面或内部抗原，包括成虫和幼虫的浸出物，感染细胞表面或寄生虫体表抗原等，这部分抗原也被认为是寄生虫的主要抗原物质；③其他抗原，包括死虫、蠕虫体腔液、包囊等，这些抗原的免疫原性较差，一般不作为制备虫苗的主要成分。从功能上分，寄生虫抗原可分为：①宿主保护性抗原，这部分抗原诱发宿主产生保护性免疫反应，对宿主保护性抗原的筛选与大量制备是研制虫苗的关键；②免疫诊断性抗原，宿主保护性抗原与免疫诊断性抗原并没有严格的区别，保护性抗原也可作为诊断用，但诊断性抗原不一定完全是宿主保护性抗原，有一部分虫体抗原虽然具有一定的反应性，但所诱发的免疫反应却没有保护作用，是对保护性免疫反应的干扰，一般制备虫苗的抗原应将这部分抗原去掉；③免疫病理性抗原，这部分虫体抗原可诱发宿主产生免疫病理反应，如超敏反应、免疫抑制等；④寄生虫保护性抗原，它是与诱发对寄生虫保护性免疫反应有关的抗原，有些寄生虫（如日本血吸虫）可合成一些伪装抗原，避免宿主对其识别和清除。由于寄生虫组成的复杂性，精确地分析其抗原组成至关重要。以往制备的各种寄生虫虫苗的保护作用不佳的一个主要原因就是没能确定其宿主保护性抗原。最近的研究发现，宿主保护性抗原的决定簇又分为B淋巴细胞决定簇和T淋巴细胞决定簇。只有B淋巴细胞决定簇的抗原是不完全的，也不能诱发宿主产生持久的保护性免疫应答；而T淋巴细胞决定簇，尤其是刺激宿主大量产生CD4+T细胞和CD8+T细胞的抗原，对宿主的保护性免疫应答是非常重要的。这一点已在疟原虫虫苗研制过程中得到了证实。四、寄生虫的免疫逃避机制宿主寄生虫之间的关系几乎和生命本身一样，经历了久远的年代。可以肯定地说，我们今天所认识的寄生虫是生物长期进化过程中的胜利者。因为寄生虫已完成了对宿主及环境变化的适应过程。可以想象，那些致病力很强的寄生虫可能已将其宿主物种消灭，而同时也消灭了那些寄生虫虫体本身；另一方面，完全有效的宿主抗虫反应，也有可能已经根除了寄生虫的感染。因此，一种在宿主体内已经适应的寄生虫必须不对宿主产生致命性的危害，除非某些寄生虫赖以传播的途经必须是其宿主被别的动物所吞食。所以说，现今的寄生虫是一个经过高度选择的种群，它们在进化过程中已经获得了某种（或某些）自我保护的独特功能。这种独特功能就表现在寄生虫能够在可致命的免疫攻击的环境中存活（或生存）下来。这就是所谓的寄生虫免疫逃避机制。有关寄生虫的免疫逃避机制一直是各国寄生虫学工作者研究的重点之一。已经确认的逃避机理包括：①避开或抵抗免疫攻击的部位；②不断改变虫体本身的抗原性；③降低宿主的免疫应答。（一） 解剖或组织位置的隔离有些寄生虫在长期衍化过程中形成了自己独特的亲组织性或亲细胞性，利用宿主的某些部位保护自己。有些原虫（如弓形虫、泰勒虫、利什曼原虫、巴贝斯虫等寄生在宿主的免疫细胞或红细胞内，宿主的细胞膜就构成了虫体免受免疫效应因子攻击的天然屏障。一般认为寄生虫之所以能够在特定的细胞内寄生，与其对宿主细胞的识别有关。巴贝斯虫、疟原虫都是依靠其顶复合体对红细胞受体的识别才侵入细胞内的。宿主组织内的寄生虫所形成的包囊，也是对免疫反应的有效屏障。肌肉期旋毛虫所形成的包囊、棘球蝴囊、贾第虫包囊等不但使寄生虫逃避了宿主免疫系统的识别，还防止抗体及其他效应因子向囊内的渗入，使囊内虫体得以生存。在自然体腔（如肠道）内寄生的原虫和蠕虫自然受到一定免疫保护。虽然宿主对这些虫体均能表现不同程度的免疫反应，但这种反应必然有限。分泌到肠道内的抗体和细胞因子的浓度及作用均受到肠内容物的干扰，也会由于肠管的蠕动而影响作用时间，因而对肠道内寄生虫的保护性免疫是非常有限的。（二） 虫体抗原性的改变抗原性的改变，被认为是某些寄生虫最重要的免疫逃避机制。寄生虫（如锥虫、巴贝斯虫等）在宿主产生有效的免疫反应之前，即已改变了其表面的抗原性，使宿主免疫效应系统对其失去了作用。寄生虫改变自身抗原性的机制主要表现在以下几个方面：寄生虫抗原的阶段性变化寄生虫发育过程中的一个重要特征是存在阶段性（发育时期）甚至宿主的改变。例如，疟原虫、巴贝斯虫在发育过程中有裂殖子期、孢子期等，其间经历哺乳动物宿主和昆虫宿主两个发育繁殖阶段，在不同的发育时期内其本身的抗原性均有不同的变化。对于宿主来讲，每一个发育时期的虫体均是一种新的抗原。至于线虫的生活史就更为复杂，从虫卵到幼虫，再发育到成虫，各个时期的抗原成分也不相同。虫体的连续变化，无疑干扰了宿主免疫系统的有效应答。抗原变异所谓抗原变异是指特定发育阶段的寄生虫改变其表面抗原血清型的能力，它是寄生虫最有效的免疫逃避机制。多种致病性原虫和非致病性原生动物（如草履虫）均具有表面抗原变异能力。通过不断改变其表面的抗原决定簇，而使原虫作为一个整体在不利的环境条件下残存下来。在多数寄生虫的抗原变异现象中，尤以锥虫、疟原虫和巴贝斯虫最具特征。在布氏锥虫（Trypanosomabrucei）组的锥虫表面都有一层约12〜15nm的电子致密层，其主要由分子量为55kD〜65kD的糖蛋白组成。由于该种糖蛋白的抗原性不断发生改变，人们将其称为表面变异糖蛋白（variablesurfaceglycoprotein，VSG）。VSG每隔一段时间就从虫体上脱落下来，而被新的抗原型的VSG所取代，而且每一次VSG的产生都比宿主产生特异抗体的时间快。所以，尽管VSG具有很强的抗原性，宿主对由新的VSG伪装的锥虫仍是视而不见。疟原虫和巴贝斯虫的抗原变异虽然没有锥虫快速和彻底，但是足以干扰宿主对这两种虫体的免疫清除。其主要表现在改变虫体表膜或其所寄生的红细胞膜上的抗原性，而不是整个虫体表膜的抗原性全部改变。另外，在巴贝斯虫的分泌抗原中，有一部分抗原也属于变异抗原。关于寄生虫的抗原变异机理，一般认为是由变异基因所决定的，但不同虫体的抗原变异基因的表达方式不同。在锥虫，编码VSG的基因分布在虫体染色体的各个部位，在某一特定的时期内，只有一个基因表达。这个基因就是位于染色体端粒附近的基因。其他VSG基因只有位移(translocating)到端粒表达位置才能被表达。据认为，锥虫本身具有一种核酸剪切因子，它可以使不同的VSG基因移位到表达位点。目前国外有关研究机构正在对这种剪切因子进行研究。与锥虫的抗原变异不同，巴贝斯虫和疟原虫的基因组内都有一些基因重排位点(rearranginglocus)，由这些位点所转录的mRNA分子各不相同，因而所翻译的蛋白质的抗原性各异。但这些变异抗原对整个虫体的抗原性有时并不起决定性作用。寄生虫抗原变异的另一个机制是虫株之间的杂交或融合。大量的研究发现，不论有性繁殖的巴贝斯虫、疟原虫，还是无性繁殖的锥虫，其在宿主体内都可以进行遗传物质的交换。当两个抗原性不同的虫体杂交或融合后，其子代虫体的抗原性有可能与母代完全不同，这一推论已经在疟原虫研究中得到证实。最后需要指出的是，寄生虫的抗原变异并不是无法克服的。作为一个虫体的基因组，其所包含的基因毕竟是有限的。无论锥虫还是疟原虫和巴贝斯虫，其抗原变异均有一定的规律性。研究结果表明，不论何种抗原型的虫体，经过昆虫体内的发育繁殖过程后，其抗原性均趋统一，即由昆虫初次传播给哺乳动物的虫体的抗原有很大的同源性，这就为制备虫苗提供了一个重要依椐。实际上，即使不同抗原型的VSG，在其多肽链的C末端也有一定的同源性，只是由于其疏水性而不能暴露于虫体表面而已。抗原摹拟和伪装有些寄生虫(如血吸虫)能够将宿主分子结合在其体表，或在体表表达宿主分子，从而减少寄生虫与宿主之间的抗原差异，进而逃避了宿主的免疫识别和免疫清除。关于摹拟宿主抗原的现象，首先在血吸虫得到证实。早在60年代就有实验证明，用小鼠组织匀浆或红细胞免疫猴，再将小鼠体内的成熟曼氏血吸虫感染猴，结果鼠源血吸虫在抗鼠猴内很快被杀死。将鼠源血吸虫感染正常猴，则虫体能正常存活，这说明在血吸虫表面有鼠源抗原。同样在日本血吸虫中也发现了类似的宿主抗原。关于血吸虫体表的宿主类似抗原(或称共同抗原)的来源有三种学说:①自然选择学说;②抗原诱导学说;③抗原面具(mask)学说。前两种学说认为寄生虫具有自身合成宿主抗原的能力，而后一种学说则认为寄生虫表面抗原是从宿主获得的。自然选择学说认为寄生虫在进化过程中，一些虫体自然获得了摹拟宿主抗原的能力，而那些不具摹拟抗原能力的虫体则被消灭。抗原诱导学说认为虫体对宿主抗原具有识别能力，受宿主抗原(或环境)的刺激，寄生虫可以按照宿主抗原的密码子表达宿主抗原。也有人认为寄生虫是吸收了宿主的DNA序列，在虫体内合成了宿主蛋白。抗原面具学说则认为寄生虫的表面抗原完全是从宿主吸附上去的。三种学说各有道理，并有各自的实验依据，但又都不能解释所有的抗原摹拟现象。这可能是由于不同的虫体具备不同的抗原摹拟机制的缘故。表面抗原的脱落与更新多数原虫和蠕虫都有脱落和更新表面抗原的能力，这也是它们逃避宿主的特异性免疫反应的有效方式。实际上，抗原脱落与抗原变异是相互结合的。锥虫的VSG就是始终处在一种不断产生和脱落的过程中。脱落下来的抗原中和了特异抗体对虫体的作用。疟原虫和巴贝斯虫在侵入红细胞的同时，都将其表膜的部分抗原留在红细胞的表面，而红细胞内的虫体表面抗原又有所变化。利什曼原虫从鞭毛体向无鞭毛体转化过程中，也有部分抗原的脱落。血吸虫成虫在受到特异抗体作用时能脱去部分表皮，然后又可修复。此外，血吸虫还可进行正常的皮层转换。尾蝴钻穿皮肤时迅速脱去其表皮的多糖蛋白质复合物，皮肤中的童虫也能脱去表面抗原而保持形态完整。另外，有些线虫（如猪蛔虫）的幼虫，在宿主体内移行过程中要经过正常的脱皮过程，才能发育至成虫，每次脱皮后的虫体的抗原性均有所改变，这也可能是其逃避宿主免疫攻击的一种方式。（三）降低宿主的免疫应答寄生虫降低宿主免疫应答的过程，实际是一种主动抑制宿主对其所进行的免疫清除的作用，是寄生虫与宿主之间相互对抗的表现。抑制溶酶体融合与抗溶酶体酶吞噬细胞或其他吞噬细胞杀伤或消化微生物的机理主要是细胞内的溶酶体与吞噬体的融合，进而释放溶酶体酶（水解酶），使被吞噬的微生物消化。吞噬体与溶酶体的融合是病原体被消化并最终被消灭的先决条件。有些原虫（如弓形虫、利什曼原虫）能够在吞噬细胞内存活，主要是由于它们能够抑制吞噬体与溶酶体的融合，以避免溶酶体中水解酶的有害作用，对含有弓形虫吞噬体的吞噬细胞的电镜观察发现，吞噬体被细胞内质网包围，而溶酶体被排斥到其他部位。利什曼原虫前鞭毛体对吞噬细胞的杀伤作用较无鞭毛体敏感，需要转化成无鞭毛体才能在吞噬细胞内生存。而且无鞭毛体可以在吞噬体内发育繁殖。现已证明，杜氏利什曼原虫能进入非吞噬细胞如成纤维细胞并转化为无鞭毛体，从而逃避吞噬细胞的攻击。墨西哥利什曼原虫具有抑制溶酶体酶的能力，它含有很多内源可溶性半胱氨酸蛋白酶，此酶可灭活溶酶体酶。但是无论哪一种原虫，一旦其体表结合有特异性抗体，其在吞噬细胞内往往被溶酶体所消化。免疫抑制寄生虫感染过程中发生的免疫抑制是一种普遍现象，原虫、线虫甚至昆虫感染都有免疫抑制，而且这种免疫抑制是一种主动抑制，即寄生虫释放的某些因子直接抑制了宿主的免疫应答。锥虫在宿主体内可分泌多种免疫抑制因子，其中有一种为有丝分裂原，这种物质可刺激宿主产生大量的非特异性IgM，在降低特异性IgG产生的同时，使宿主的免疫系统逐渐衰竭°Leslie（1986）发现感染刚果锥虫的小鼠虫血症的发展与血液中白细胞介素下降呈平行关系，认为虫体的分泌物可能直接抑制白细胞介素的产生。然而，更多的学者则认为，锥虫感染过程中的免疫抑制是由于刺激宿主产生了大量的抑制性T淋巴细胞的结果。虫体毒素是寄生虫的重要免疫抑制因子。寄生虫（尤其是血液原虫）在宿主体内大量繁殖的同时，也释放出大量对宿主有害的毒素，这些毒素不但损伤免疫器官，对各种实质器官（如肝、肾、脾）以及骨髓都有很强的毒害作用，在严重虫血症的宿主，其免疫系统几乎呈现衰竭状态。此外，寄生虫保护性抗原也参与了对宿主的免疫抑制，在虫体的分泌物/排泄物中，有一些抗原中和了宿主的抗体，而寄生虫本身则逃避了免疫清除。总之，在寄生虫诸多免疫抑制因子中，抑制性T淋巴细胞刺激因子可能起关键作用。有人认为这是传统寄生虫虫苗免疫效果不佳的一个主要原因。一个理想的寄生虫虫苗应该是不含这种因子的虫苗。补体的灭活与消耗实验证明，曼氏血吸虫的肺期童虫和培养中的童虫具有抗补体损伤作用。血吸虫分泌的蛋白酶和膜蛋白也具有抗补体作用，这些酶可直接降解补体，还可抑制补体的激活过程。另一方面，自成虫和虫卵提取的某些可溶性抗原物质和抗原抗体复合物能有效地激活补体的经典途径和替代途径，并消耗某些补体成分，以保护血吸虫本身。巨颈绦虫在发育阶段产生和释放出一种糖蛋白，能通过旁路途径消耗补体。细粒棘球蝴的囊液成分具有结合补体活性，从而保护了原头节免受补体介导的溶解作用。血液寄生原虫产生大量的分泌/排泄抗原与抗体形成免疫复合物后，消耗大量的补体，从而保护了虫体免受补体的损伤。另外，虫体的某些毒素也有直接的抗补体作用。裂解抗体一些克氏锥虫株的锥鞭毛体能抵抗抗体依赖的补体介导的溶解作用。在与特异抗体反应后，原虫表面的免疫球蛋白的Fc片段被切除，只剩下Fab片段。用抗Fab抗体处理虫体后，锥鞭毛体很快被补体所溶解，可见克氏锥虫能分解附着的抗体，留下的Fab片段不能激活补体，却封闭了虫体与特异性完整抗体的反应。曼氏血吸虫也有这种情况，它以抗体的Fc片段与补体结合，而使抗体的Fab片段游离在其表面°Fab片段只能在童虫表面吸附很短时间，其水解产物还能抑制单核巨噬细胞的吞噬作用。动物宿主的特异性和非特异性免疫反应的主要作用在于发现和清除侵入体内的抗原。寄生虫能在宿主体内持续存在，反应了宿主消灭寄生虫的生理功能的失效。从进化角度看，专性寄生虫与宿主的长期共存，实际上是宿主免疫防御系统对病原的反应与后者抵抗、干扰和逃避这种有害反应之间的一种平衡。宿主与寄生虫关系的研究是很重要的课题。对寄生虫免疫逃避机理的进一步揭示，将使人们能够更深入地理解寄生现象的免疫学基础，为干扰寄生虫高度发达的存活机理及制备高效寄生虫虫苗提供理论依据。淋巴细胞激活与白细胞功能的改变有些原虫感染可通过一定途径引起多克隆B细胞激活，产生高水平的免疫球蛋白，进而成为全身性免疫抑制的一个原因。非洲锥虫病的特征之一是高丙种球蛋白血症，尤其是IgM。感染早期，由于含膜成分及锥虫产物的作用，导致B细胞和T细胞的激活，继而引起非特异免疫球蛋白和自身抗体的增加，最终导致产生抗体能力的耗竭和B细胞与T细胞记忆的丧失。疟疾感染也刺激非特异免疫球蛋白的产生。恶性疟原虫培养物的提取物或上清液则刺激人周围淋巴细胞和小鼠脾脏细胞的转化。内脏利什曼病最显著的征象之一是循环免疫球蛋白水平的明显升高，主要是IgG，其次为IgM。免疫复合物的作用多种寄生虫感染中均能测出循环免疫复合物，这在理论上能改变宿主免疫反应，影响寄生虫的存活。曼氏血吸虫感染者血清中存在循环抗原。可在宿主体内形成可溶性免疫复合物。实验证明，这种复合物可能改变宿主免疫反应，如抑制嗜酸性粒细胞介导的对童虫的杀伤，抑制淋巴细胞转化等。分泌物、排泄物对宿主的干扰有证据表明，在囊尾蝴病和包虫病中的寄生虫产物可抑制宿主酶，影响宿主细胞的分化和活动能力，限制对有丝分裂原的反应，降低粒细胞对吞噬物的降解功能，引起补体的非特异消耗等。对宿主酶的抑制是保护线虫成虫免受肠道分泌物威胁的一种手段。例如，体外培养的豆状囊尾蝴能释出一种对胰蛋白酶和糜蛋白酶的低分子量的有效抑制剂。实验证明，巨颈绦虫幼虫可能含有调节局部炎症反应的物质。多种绦虫幼虫的提纯糖脂对哺乳动物细胞（包括粒细胞）有高度的细胞毒作用。还证明巨颈绦虫幼虫能产生和释放可能是体内的免疫逃避机理的构成部分。吸虫（如肝片吸虫）产生的物质可能防止免疫效应细胞发挥作用，或防止特异抗体的附着。吸虫的分泌物/排泄物能在体外杀伤淋巴细胞，这类物质在吸虫寄生的肝胆管部位浓度较高，因而使寄生虫能在这些部位克服宿主的防御功能。抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）是机体抗寄生虫感染的一种免疫防御反应，无论在蠕虫、原虫，还是在体内或体外均得到证实，而且认为是杀伤蠕虫的重要效应机制。由于宿主感染寄生虫后的不同时期产生不同的特异性抗体，从而确切地控制ADCC活性，使杀虫过程表现为持续的连锁反应°ADCC杀伤的靶子，主要是幼虫，如血吸虫童虫、旋毛虫的新生幼虫。细胞因子如白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子在抗寄生虫感染免疫中亦起重要作用。已知IL2是激活T细胞产生的一种淋巴因子，在寄生虫感染的细胞免疫和体液免疫中必有可少。IFNy在免疫应答中除了促进M中加工抗原外，在疟疾免疫方面，它可起佐剂作用，以及对肝内期的寄生产生保护作用，还可起着被寄生细胞的信息传递作用。20世纪80年代后，TNF在寄生虫感染中的重要性受到注意；在疟疾感染中人们首先认识IFN参与复杂的杀死疟原虫过程。现已清楚，疟原虫刺激淋巴细胞，所产生的IFNy作用于M中使之产生TNF，后者作用于M中和中性粒细胞，促使它们产生氧自由基，直接参与杀灭疟原虫。这一过程对宿主是有利的。补体在寄生虫感染中的作用，特别是曼氏血吸虫方面已有所了解。如尾蝴及刚刚转变的童虫都可激活补体的替代途径，实验动物的免疫血清及人的感染血清含有激活补体作用的抗体，被抗体激活的补体能协助抗体对童虫发挥更大的杀伤作用，补体可作为细胞攻击的介质，在有或无抗体存在的条件下，均可使嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和哑中结合于童虫引起特异的损伤。五、寄生虫虫苗寄生虫免疫学研究的重要目的之一是制备最有效的寄生虫虫苗，进行特异性免疫预防，以控制甚至最终消灭寄生虫病。寄生虫虫苗是最具挑战性的课题。近一个世纪以来，世界各国的寄生虫学家们在这一领域进行着不懈的探索，有过成功的喜悦，也有过失败的困惑。但无论研究工作如何艰难，人们相信，人类一定会最终战胜寄生虫的危害。从科学的角度讲，寄生虫必竟是一类低等的真核生物，不管其如何对宿主环境适应性变化，其内在的本质规律一定会为人类所揭示。人们在制备寄生虫虫苗的方法学上进行了最广泛的探索，随着免疫学、细胞生物学、分子生物学技术在这一领域的不断应用，寄生虫虫苗的研究已经取得了令人振奋的进展。(一)寄生虫虫苗的种类致弱虫苗致弱苗是最早期也可以说是第一代寄生虫虫苗。临床上处于带虫免疫状态的人或动物对同种寄生虫的再感染均表现不同程度的抵抗力。因而可以将强毒虫体以各种方法致弱，再接种易感宿主，以提高宿主的抗感染能力。致弱寄生虫毒力的方法主要有以下几种：筛选天然弱毒虫株：每一种寄生虫种群的不同个体或不同株的致病力虽不同，但其基因组成可能相同。有些致病力很弱的个体是天然致弱虫株，是制备虫苗的好材料。最成功的要属鸡艾美尔球虫早熟弱毒株的筛选。在艾美尔球虫中有一些虫体的潜隐期较正常虫体提前，而这部分虫体的毒力往往较弱。将早熟虫体筛选出来，制备成虫苗，再免疫易感鸡，这一尝试已在很多国家取得了成功。人工传代致弱虫株：有些寄生虫，特别是那些需要中间宿主的寄生虫(如巴贝斯虫、锥虫)在易感动物或培养基上反复传代后，其致病力会不断下降，但仍保持抗原性。故可以通过传代致弱法获得弱毒虫株制备虫苗。体内传代致弱法：早在20世纪50年代澳大利亚学者Callow(1979)就以体内传代方式成功地制备了至今在一些地区还在使用的牛巴贝斯虫弱毒虫苗。他将牛巴贝斯虫在犊牛体内反复机械地传代15代以上，使虫体的毒力下降到不能使被接种牛发病的程度。以这种虫体作为虫苗，广泛接种易感牛可预防牛巴贝斯虫病。但是这种虫苗有一定的弱点，其一是部分虫体处于暂时致弱状态，一旦回到自然状态，经媒介蝉的反复传代以后，有的可恢复毒力;其二是有传播牛口蹄疫和白血病的危险；其三是不易体外保存和运输。体外传代致弱法：体外致弱就是将虫体在培养基内反复传代培养，最后达到致弱虫体的目的。当前，很多寄生虫的体外培养方法均已建立并制成商品苗，而广泛推广使用。例如，艾美尔球虫的鸡胚传代致弱苗(如英国的Paracox和Livacox弱毒苗)和牛泰勒虫的淋巴细胞传代致弱苗都是很成功的体外传代致弱苗。射线致弱虫株：早在1914年Halbertdter就指出用镭Y射线照射可致弱锥虫的感染力。此后，人们几乎以不同的放射线(尤其以6Co、Y射线用的最多)和剂量对所有的寄生虫进行过照射减毒试验，其结果也不统一。其中最成功的要属对牛网尾线虫的试验。Jarrett(1957)首先以X射线照射法制备了牛网尾线虫苗。据报道，胎生网尾线虫和丝状网尾线虫的致弱苗可以诱导90%以上的保护率，而犬钩口线虫的致弱童虫苗已经商品化。药物致弱虫株：药物致弱法是以亚治疗量的药物在体内或体外对虫体进行作用，以降低虫体的活力。实际上是使宿主处于长期带虫免疫状态。国内外的学者曾分别对伊氏锥虫和牛巴贝斯虫进行过化药致弱试验，但实践表明，这种方法有导致产生耐药性虫株的危险，目前也不被人们所使用。抗原苗由于致弱苗存在诸多的缺陷，包括用于制备虫苗用的虫体来源紧张、保存和运输有一定困难，限制了其在生产中的应用，使得这些致弱虫苗的研究大多数只停留在实验室阶段。目前人们已将重点转移到寄生虫抗原苗。制备寄生虫抗原苗是将寄生虫的有效抗原成分提取出来，加以相应的佐剂，再免疫动物。实践证明，这种类型的虫苗是最有前途的虫苗，制备这类虫苗的关键是确定和大量提取寄生虫有效的保护性抗原。制备对宿主的保护抗原苗有两种，即传统寄生虫虫苗和分子水平寄生虫苗。传统寄生虫抗原苗：一般认为寄生虫可溶性抗原(包括ES抗原)的免疫原性最高。起初，人们制备蠕虫可溶性抗原，多将活虫杀死，再以机械方法打碎，提取其可溶性部分或虫体浸出物，经过浓缩等处理后免疫动物。这种方法遇到的一个重要问题是虫体来源有限。另一方面，在这种混合抗原内，绝大部分为非保护性抗原，因而免疫效果也不很理想。在寄生虫(尤其是原虫)的体外培养技术建立以后，很多寄生虫(如巴贝斯虫、锥虫、疟原虫)可以在体外大量繁殖，从而为提取大量的虫体ES抗原奠定了基础，其中最成功的要属巴贝斯虫培养上清苗。无论法国的犬巴贝斯虫苗还是澳大利亚的牛巴贝斯虫苗，在当地巴贝斯虫病的免疫预防方面都发挥着十分重要的作用。但以这种方法制备的锥虫虫苗，却没有取得人们预计的保护效果。分子水平寄生虫抗原苗：制备有效寄生虫虫苗的关键是获得大量的宿主保护性抗原。一般常规方法，包括层析技术所提取的抗原也只能进行小型实验室实验。随着重组DNA技术的不断成熟，运用分子克隆技术可以获得大量纯化的寄生虫抗原，将使一些来源困难的虫体在分子水平上得到较好的研究，虫苗的研究开始转向基因工程苗。可以预计，分子生物学方法是解决新一代寄生虫虫苗制备方法的最有效途径之一。基因工程抗原苗：将寄生虫抗原(宿主保护性抗原)的基因分离、克隆后，在高效表达载体上表达。从而得到大量纯化的单一抗原。也可以将多个抗原基因克隆在同一个载体内，以获得同时表达的多价载体。用于表达寄生虫抗原的系统主要有：大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞系统。具体是：①大肠杆菌是最早用于表达克隆基因的细菌，其主要优点是繁殖快，易于操作。外源基因的载体主要有质粒载体和入噬菌体载体两种，两种载体都可用于寄生虫抗原基因的克隆和表达，尤以入噬菌体最常用，主要是噬菌体的包装效率远远大于质粒，对于构建完整的基因文库是非常有利的，另外，还可以用抗寄生虫特异抗体对表达子直接进行原位筛选，目前，在大肠杆菌内表达的寄生虫抗原有20多种，重组抗原的免疫原性也不尽相同，实际上，大肠杆菌只能作为克隆基因的初级表达系统，对于表达真核生物的基因有诸多缺陷，如不能表达含有内含子基因，不具有分泌功能，重组抗原易形成包含体；有些寄生虫抗原为糖蛋白，大肠杆菌内缺少使重组蛋白质糖基化的功能;②分枝杆菌是最近几年才发现的可表达抗原基因的细菌，我们知道BCG是世界上应用最广泛也是最有效的疫苗之一，因此有人设想利用BCG的高免疫特点，将寄生虫等抗原基因在分枝杆菌内表达，制成复合型卡介苗，然后免疫动物或人，目前转化分枝杆菌的表达载体已经构建成功，已有包括疟原虫在内的十多种寄生虫基因在分枝杆菌内进行了表达试验，结果表明，虽然重组蛋白的表达量并不很高，但其免疫原性却很高，有人认为重组卡介苗可能是最有希望的基因工程苗；③酵母菌具有真核细胞的一些特性，更适合于表达真核生物基因，但只能用质粒转化酵母菌；因此，酵母菌不适合用于构建文库，而较适合于对已经被克隆的基因的表达，间日疟原虫、恶性疟原虫的基因都在酵母菌中得到了表达，Loison(1989)将曼氏血吸虫谷胱甘肽S转移酶(GST)基因在酵母菌中高效表达后，亲和层析提取的重组GST具有虫源性GST活性，而GST正是制备血吸虫虫苗的主要成分之一;④哺乳动物细胞是最高级的反应器，它具有组装和修饰蛋白质的所有结构，对于表达寄生虫膜蛋白和对蛋白质二级或三级结构依赖性强的抗原最为有利，但用哺乳动物细胞表达外源基因，无论转化系统还是表达后的检测都较复杂，目前只有恶性疟原虫的表面抗原基因在猴COS7细胞内作了表达试验；⑤在昆虫细胞表达的寄生虫抗原基因有恶性疟原虫裂殖子表面抗原和环子孢子(CSP)抗原基因，以及弓形虫P30基因，将表达产物连接上一定的信号肽序列以后，就可以分泌到细胞外，并保持完整的抗原性。新候选抗原基因的筛选工作主要是用慢性感染动物的抗血清或用特定抗原提取物制备的抗血清进行。Balloul(1987)用重组的Sm28GST(曼氏血吸虫28kD谷胱甘肽S转移酶)免疫大鼠获得成功，随后，Johnson等于1989年也克隆到具有保护作用的羊带绦虫的45W(分子量为47~52kD)抗原基因。羊带绦虫45WGST融合蛋白是第一例成功的抗寄生虫重组虫苗，45WGST也可以诱导较高水平的IgGl，IgG1的水平与保护率呈正相关，该重组抗原即将商品化。此外，还有16kD和18kD的抗原分子也已被克隆，而且被证明有保护力，这些抗原可以交替使用，避免羊羔体内母源抗体对相应抗原初次免疫的干扰。Lightowlers(1995)还报道了用细粒棘球蝴重组抗原Eg95EST融合蛋白可以在绵羊诱导高达95%以上的保护率。人工合成肽苗：人工合成肽是以化学方法合成的蛋白质肽链。Aronon(1971)提出用化学合成的多肽代替天然蛋白质肽链，并证明这种合成肽也可激发宿主产生免疫应答。从此开始了人工模拟病原(细菌、病毒、寄生虫)组分的合成肽研究时代。1983年纽约大学首先克隆了编码诺氏疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的基因，序列分析表明，CSP分子的免疫显性表位含有一个由12个氨基酸重复排列12次而形成的结构单位。以化学合成的该氨基酸序列免疫猴，诱导产生了子孢子中和抗体。Good等(1987)将恶性疟原虫CSP的T淋巴细胞和B淋巴细胞识别位点共价结合在一起，制备双价合成多肽虫苗，免疫结果表明，可激发宿主产生高滴度的抗体应答。制备合成肽虫苗的关键是对保护性抗原的DNA或氨基酸序列分析。目前还不能将整个抗原多肽都合成出来，因此对抗原决定簇的分析至关重要。另外，载体和免疫增强剂的选择也是不可少的，因为合成肽一般均为寡肽，单独作为抗原免疫的效果不理想。基因工程抗体苗20世纪80年代初期发展起来的应用基因工程生产重组抗体，和应用二次杂交瘤(hybridhybrdoma)技术生产双特异性McAb理论和方法的提出，开始了抗体理论与应用的新时代。根据抗体也是抗原及在多种免疫细胞上都有Fc受体的理论，抗体是向免疫细胞递呈抗原的最有效的工具。因此，有人设想将抗体分子的重链可变区由抗原决定簇序列取代，制成嵌合抗体，也称为抗原性抗体(antigenizedantibody)。通过抗体本身的抗原性和抗原递呈作用，增加抗原的免疫原性。目前，这一大胆设想已在寄生虫虫苗研制过程中进行了初步尝试。Sollazzo(1990)将恶性疟原虫CSPB淋巴细胞决定簇(一个富含脯氨酸四肽重复排列基因)移殖到鼠抗体H链内，将这种工程抗体分别免疫家兔和小鼠，结果两种动物均产生了抗恶性疟原虫的免疫应答，而且被诱导产生的特异抗体在体外可完全阻止子孢子侵入肝细胞。目前这一研究还在进行之中。除此之外，有人还设想以同样方法制备：①可溶解寄生虫关键蛋白质的抗体；②可在寄生虫表面打洞的抗体一穿孔素(perforin)杂交分子；③可突破寄生虫表膜防线的“小抗体”；④为免疫效应细胞提供攻击目标的双特异性抗体；⑤拦载寄生虫入侵宿主细胞的双特异性抗体；⑥可调节宿主抗虫免疫和免疫病理的双功能抗体。所有这些设想的实施，必将开创寄生虫虫苗研究的新时代。抗独特型抗体苗(antiidiotypicvaccine)1974年，Jerne提出的著名免疫调节网络学说，为抗独特型抗体疫(虫)苗的研究提供了理论基础。Nisonaff(1981)首次提出具有内影像作用的抗Id苗有其三大优点：①以常规的方法不能或难以得到大量纯净的寄生虫原始抗原物质，如细胞内寄生的原虫、肌肉内寄生的旋毛虫幼虫等，可用抗Id代替；②非肽类抗原无法用基因工程等方法大量合成，这类虫体抗原可用抗Id代替；③抗原成分未知，但能与具有抗寄生虫保护性McAb反应，并且这种McAb能诱导抗Id抗体产生。最早进行寄生虫抗Id应用研究的是Neukenzweigs(1980)，他用抗疟原虫抗体作为抗原免疫小鼠，得到了相应的抗Id抗体，再用抗Id抗体代替疟原虫抗原免疫动物，获得了抗疟原虫抗体。但后来，有人对该抗Id抗体提出了疑问。Sack(1982)以抗罗德西亚锥虫的McAb成功地在SJL小鼠体内诱导产生了抗Id抗体(据认为，该抗体才是第一个寄生虫抗Id抗体)，以此抗体为抗原免疫的BALB/C小鼠能产生可抵抗该锥虫感染的特异性抗体。在此基础上，Sacks(1985)又研制出了枯氏锥虫表面糖蛋白(72kD)的抗Id抗体，该抗体所诱导的抗体与72kD表面糖蛋白的反应良好。Grzych(1985)报道，曼氏血吸虫表膜上一分子量为38kD的糖蛋白，对人和动物具有强烈的免疫原性，在嗜酸性白细胞的协同下，抗该抗原的McAb对虫体具有明显的杀伤作用。以抗该McAb的抗Id抗体免疫大鼠，保护率可达76%。另据报道，Percy(1988)用曼氏血吸虫虫卵及幼虫的可溶性抗原制备McAb，用抗Id抗体免疫的动物，对同种虫体的攻击可产生33%〜100%的保护力。此外，Stevenson(1986)和Bhogal(1988)还分别报道了用抗独特型抗体预防黑热病和禽艾美尔球虫病的实验。由此可见，抗独特型抗体确实代表了一种新的制苗方向。但到目前为止，多数抗Id抗体的免疫效果均不稳定，这可能与抗体的制备方法、免疫途径和免疫剂量有关，其中最重要的是应该相对提高针对寄生虫的宿主保护性抗原的抗独特型抗体的含量。核酸疫苗 现有寄生虫疫苗由于种种原因，其保护率还不能令人满意，核酸疫苗的出现，给抗寄生虫免疫带来了新希望。迄今为止，主要开展了对疟原虫、囊虫、血吸虫及利什曼原虫等核酸疫苗的研究。(二)当前研制的几种重要寄生虫虫苗疟疾虫苗目前，疟疾是危害人类最重要的侵袭病之一。据WHO1992年统计，每年有200万人死于该病。目前，在疟疾流行区内，各种疟原虫对传统药物一氯喹均产生了不同程度的耐药性。所以对疟疾的防治，人们把希望寄托于疟疾虫苗的研制上。对抗疟疾虫苗的研究已近50年，最早是采用死虫苗或射线致弱苗，尽管这些虫苗都有一定的保护作用，但效果还不尽人意。近几年来，随着分子生物学、分子免疫学技术在疟疾制苗研究上的应用，各种疟原虫的宿主保护性抗原已经基本确定，而且这些抗原的基因重组表达及合成多肽的方法业已建立，有些研究已经取得了令人鼓舞的成绩，各种虫苗都在不同地区进行着临床试验。其中希望比较大的主要有：①抗子孢子苗；②抗裂殖子苗；③多价杂合抗疟虫苗sp66。子孢子是疟原虫经蚊虫叮咬进入哺乳动物宿主的初级阶段，其表面有一种蛋白质，称为环子孢子蛋白(circumsporozoiteproteinCSP)，其分子量约为40〜60kD，不同的成熟子孢子表面都有这种蛋白。已经证明，CSP是疟原虫抗原中最重要的宿主保护性抗原之一。在其多肽链的中央区含有B淋巴细胞、T淋巴细胞表位，其中尤以B淋巴细胞表位最重要。80年代中期，纽约大学科学家们成功地克隆7CSP基因，这一成就被认为是疟疾虫苗的里程碑。此后，该基因的重组多肽或是与载体蛋白相连，或是以融合蛋白的形式，对其中的许多候选抗原进行了临床试验°Herrington(1992)在昆虫细胞内表达了几乎整个CSP，并与佐剂Al(OH)3一起免疫了20个志愿者，结果用westernblot检查，可在所有被免疫者体内测试到特异抗体。认为该重组抗原对人体有免疫原性。目前，抗子孢子虫苗的研究重点主要集中在如何增加其T淋巴细胞表位的免疫原性方面。裂殖子(merozoite)是疟原虫的红内期虫体，也是疟原虫的主要致病时期。在这期虫体上的虫苗候选抗原主要是裂殖子表面抗原(MSA1、MSA2)和RESA。MSA1是裂殖子主要表面抗原的前体，分子量在180〜220kD之间，由1640个氨基酸组成。有人把MSA1的多个B淋巴细胞和T淋巴细胞表位与RESA杂合，可诱导动物产生明显的体液和细胞免疫应答，并获得抗感染免疫。现已证实，MSA1的抗原决定簇在其多肽链的N末端，该部位的序列保守，且同时含有B淋巴细胞和T淋巴细胞激活表位，是较理想的虫苗候选抗原OMSA2是一种分子量为45kD的蛋白质，其肽链的N末端均比较保守，但其中间区才是免疫原性区，可诱发高滴度的抗体应答。鉴于MSA2具有许多可激活B淋巴细胞和T淋巴细胞的表位，免疫动物可获得较好的保护性，也是有希望的虫苗候选抗原之一。RESA是恶性疟原虫成熟裂殖体合成的一种155kD蛋白质，其主要抗原决定簇编码在该蛋白基因的3’末端。它主要含有T淋巴细胞表位，被免疫的动物中IL4的含量较高。多价杂合抗疟虫苗sp66是一种含恶性疟原虫三个裂殖子表面多肽(35.1、55.1、83.1)及CSP上的重复位点与Th细胞表位的杂合人工多肽°Patarroyo(1988)用该虫苗免疫人群获得较好的保护，尽管此工作在当时没有得到普遍认可，他们在南美洲再次免疫人群，又一次证实该虫苗的免疫力和保护力，且与年龄无关。用该抗原免疫小鼠，其血清可抑制:①子孢子入侵肝细胞；②裂殖子入侵红细胞；③蚊体中卵囊的发育。由此提示，该虫苗对恶性疟原虫各期都可能有效。进一步试验证实sp66虫苗对人群的有效保护率可达66.6%〜82.3%。经三次免疫的人群，其中65%的人体内的特异抗体滴度可达1：1600以上。Sedegah等(1994)用含约氏疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因的真核表达载体，肌肉注射小鼠后，同时产生抗环子孢子蛋白的特异性抗体和CTL反应，两种反应的水平均高于减毒子孢子免疫的小鼠。核酸疫苗接种后，用5X105子孢子攻击感染后的肝期原虫负荷下降86%；已接受2~3次免疫接种的小鼠，再以102子孢子攻击，结果显示疫苗对68%的小鼠具有保护作用，说明核酸疫苗接种可用于抗疟疾感染。目前，用作疟原虫核酸疫苗研究的保护性抗原基因主要有：CSP、MSA1、MSA2、SSP2、HEP17、EXP1和RESA等。1997年Nature上报道了一项临床试验，以QS21(一种编号)为佐剂，接种含环子孢子疟原虫蛋白基因的核酸疫苗，结果7个志愿者经感染有疟原虫的蚊子反复叮咬后有6人获得了保护。总之，疟疾虫苗的研究已经走过了一个艰难的历程。值得庆幸的是，已经有几种虫苗开始在人体上进行免疫试验。相信随着研究的不断深入，人类最终战胜疟疾的日子不会太远了。弓形虫虫苗近几年来，随着AIDS病人伴发弓形虫病的逐渐发现，各国加紧了对弓形虫病免疫学研究。研究发现，弓形虫约有1000种蛋白质，其中有三类蛋白质被认为是虫苗的候选蛋白：①表面蛋白类，包括SAG1(P30)、SAG2(P22)和SAG3(P43)；②致密颗粒(densegranule)内的分子，包括GRA1、GRA2、GRA3、GRA4和GRA5；③顶器内的细胞穿透因子(penetrationenhancingfactor，PEF)，包括ROP1和ROP2(P54)。SAG1(P30)是弓形虫中含量最多的一种蛋白质，由磷酸酯酰肌醇(GPI)锚定(anchored)在速殖子表面，占整个速殖子蛋白的5%，其分子量为30〜35kD。SAG1只在速殖子表达，但在所有分离株中保守。在所有急慢性的动物和人以及新生儿的血清中都可以检测到特异性抗P30抗体。经P30免疫的小鼠对弓形虫的攻击具有很强的抵抗力。进一步测试发现，鼠血清中igG、IgM、IgE、IgA(包括分泌型IgA)及IFN Y的含量明显增高。由此说明P30可诱导Th1和Th2功能。Boothroyd(1991)以P30为抗原，加以saponin、quilA及liposomes等佐剂，免疫小鼠，结果获得100%的保护，而且6周后小鼠的脑内也未发现卵囊，说明P30是一个极有潜力的，对急慢性弓形虫病都有保护作用的抗原。目前，国内外一些研究单位正在进行该抗原的基因工程合成及免疫原性试验。GRA1(P23)和GRA2是两种外分泌抗原，由速殖子和缓殖子分泌到被寄生的细胞及宿主的血液内，它们都具有很高的免疫原性。在慢性感染者体内抗两种抗原的抗体滴度较高。特异性McAb可明显抑制虫体的感染性。以虫源性GRA1和GRA2做成虫苗，可使小鼠抵抗强毒虫株的攻击。有报道认为，GRA1和GRA2主要是通过诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)的功能来实现增强免疫的。值得注意的是，纽约大学的科学家首先开始了对弓形虫转基因的研究，他们通过弓形虫的一系列基因转移或转化，获得热敏型突变株(thermsensitivemutants，Ts)oTs型虫体是人工制造的弱毒株。免疫试验表明，Ts4可使动物抵抗强毒虫体的攻击。据认为，它也是通过诱导机体产生CTL和IFNY而增强动物的免疫力的。目前，在英国和新西兰都有用这种减毒虫制备的商品虫苗。巴贝斯虫虫苗巴贝斯虫病是一种重要的血液原虫病，尤其对养牛业的危害更为严重。据统计，世界上有1.2X109头牛，其中大多数位于巴贝斯虫病的流行区。我国也是巴贝斯虫病的重要疫区，每年都有大批动物(牛、马、犬等)感染巴贝斯虫病。对巴贝斯虫虫苗的研究始于本世纪50年代。可以这样讲，巴贝斯虫虫苗的研究历史代表了整个寄生虫虫苗的研究历史。在不同的历史时期，所有虫苗的研究方法在巴贝斯虫虫苗的研究中都进行过成功的尝试。最初的巴贝斯虫虫苗是由Callow等人研制的传代弱毒苗，他们将牛巴贝斯虫在犊牛体内反复机械传代，最后使虫体的毒力减弱至不能使接种动物发病的程度。这种虫苗在澳大利亚被使用了20多年，为该国的养牛业建立了很大的功劳。进入20世纪70年代以后，巴贝斯虫的体外连续培养技术逐渐成熟，使人们可以从培养上清中分离大量的虫体ES抗原，与saponin等佐剂混合制备的抗原苗开始取代弱毒苗。其中牛巴贝斯虫和犬巴贝斯虫虫苗最为成功，目前国外已有不同类型的商品苗出售，是预防巴贝斯虫病的主要虫苗。进入20世纪80年代以后，随着细胞生物学和分子生物学技术在这一领域的不断应用，国外又开始研究巴贝斯虫的基因工程苗。其中发展较为迅速的还属对牛巴贝斯虫(包括双芽巴贝斯虫)的研究。牛巴贝斯虫的宿主保护性抗原(Bv60、Bv225)、双芽巴贝斯虫抗原(P50、P58、P70)、羊巴贝斯虫抗原(Bv60.14)、犬巴贝斯虫抗原(Bv60/P58)的氨基酸组成及基因序列均已分析清楚。其中牛巴贝斯虫的Bv60和双芽巴贝斯虫的P58抗原的体外大量合成方法已经建立。由两种重组抗原所制备的新型虫苗正在澳大利亚进行临床试验。血吸虫虫苗与其他寄生虫虫苗的研究相类似，血吸虫虫苗的研究也经历了从死虫苗、活虫苗到目前的基困工程苗和抗Id苗的发展过程。20世纪80年代是血吸虫虫苗研究最活跃的时期。在Greene和Benacerraf(1980)证明抗原皮内注射途径能有效地刺激细胞免疫的基础上，利用血吸虫抗原作为免疫原皮内注射诱导特异性免疫力的研究大量地开展起来。James(1984)应用冻融的曼氏血吸虫抗原加BCG，皮内注射免疫小鼠，结果可使小鼠的染虫率下降35%〜70%。Pearce(1986)在血吸虫的成虫可溶性抗原中分离到分子量为9