CD34+ 细胞及分离方法

CD34+细胞

分离及其体外扩增

1CD34+细胞CD34+细胞是造血干细胞的表面标志分子。细胞表面CD34+抗原是一种相对分子质量为110-120kD的高度糖基化的Ⅰ型膜蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细胞以及少量内皮细胞表面。2CD34+细胞在骨髓，脐带血以及外周血中都有存在。用常规方法一般难以有效分离。原因主要在于CD34+抗原表达的拷贝较低，抗CD34+的亲和力低，表达CD34+抗原的细胞存在于一个不均一的本底细胞群中，且数量极少。3分离CD34+细胞的方法荧光激活细胞分选免疫吸附系统（淘选法；免疫吸附柱层析法；免疫磁珠法）细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计数流式法）4流式细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)可获得高纯度的CD34+细胞，但是由于得量较少，受无菌实验条件等方面的限制，所以应用较少。细胞物理参数系统分离CD34+细胞得率较低，而且需要提供足够的细胞量。5目前常用于分离CD34+细胞的方法主要是免疫吸附法（systemsbasedonimmunoadsorption)。尤其是用免疫磁珠吸附分离（immuneadsorptiononferromagneticbeads)的方法应用更为广泛。6CD34+细胞分离方法比较7免疫磁珠吸附分离CD34+细胞利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合，使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血细胞培养，扩增，基因转染，建立造血干细胞库等实验。8实验材料：1.脐带血，外周血及骨髓标本；2.PBS缓冲溶液；3.10%BSA；4.10mmol/LEDTA；5.淋巴细胞分离液；6.MACS磁性分离仪；7.MACS分离试剂盒；9操作步骤1.配制含1%BSA和5mmol/LEDTA的PBS缓冲溶液。2.利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；3.将1*108个单个核细胞悬浮于300ul缓冲液中，利用MACS磁性分离试剂盒制备细胞悬液500ul；4.将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓慢通过分离柱。洗脱组分为CD34-细胞；5.将分离柱移出磁场，加1ml缓冲液加压洗脱，收集CD34+细胞。6.用免疫细胞化学和FACS分析CD34+细胞纯度10分离结果分离前，脐带血和骨髓的CD34+细胞占单个核细胞的1-4%，外周血仅为0.2%。分离后，CD34+细胞可达95-99%。CD34+抗原组则99.6%的细胞为CD34-细胞。回收率达70-75%，免疫磁珠分离方法得到的CD34+细胞纯度和回收率均较高。11体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞的比较目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细胞（MNC）和CD34+富集细胞，对比考察这两种细胞扩增，集落形成和CD34+细胞扩增等特性。12方法1.Ficoll密度梯度离心收集单个核细胞;2.免疫磁珠分离纯化CD34+细胞.3.MNC接种密度为5*105cells/ml.CD34+细胞为2*104cells/ml于24孔板，每周取样计数，集落检测和流式细胞分析.13结果脐血CD34+细胞的分离结果14MNC扩增到第28天，细胞总数开始呈下降趋势，而另一组则持续扩增8周。在前4周中，MNC的扩增倍数远低于CD34+富集细胞15造血干/祖细胞集落密度分析

细胞于半固体培养体系中进行集落分析，MNC的CFU-GM和BFU-E集落密度都有上升，下降的过程，而CD34+富集细胞集落密度始终呈下降趋势，相似的是两者BFU-E到第3周就很难检测到了。集落密度=集落/细胞数16造血干/祖细胞总集落扩增分析总集落数=集落密度*细胞总数MNC的CFU-GM和BFU-E的扩增倍数在14天达到最大值，然后开始下降。CD34+富集细胞的CFU-GM第35天达到最大值，CFU-E在第14天达到最大值。后者的CFU-GM最大扩增倍数远大于前者。17

分析可以看出，MNC的集落在培养过程中其集落密度和集落数量都曾实现了增高。而CD34+富集细胞的集落只实现了数量上的扩增，单个细胞所形成的集落数并没有明显的增高过程。18

显示，MNC的CD34+细胞的扩增倍数在第14天达到了最大值，随后开始下降，CD34+富集细胞则如终呈上升趋势，在第35天达到了最大值。经过体外长期培养，由CD34+富集细胞培养所得的CD34+细胞总数和CFU-GM（粒细胞-单核细胞集落生成单位）总数均高于MNC。19小结经过体外培养，培养前期MNC的CD34-可能对CD34+细胞及集落形成细胞的扩增有促进作用；而CD34+富集细胞在培养过程中分化趋势始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说明在培养中存在大量分化。20讨论与总结MACS技术在实验室处理低细胞量情况下，是目前纯化