遗传的物质基础DNA优秀课件

分子遗传学

MolecularGenetics

教学目的：学习分子遗传学的基本理论，重点是遗传物质在分子水平上的遗传信息流向和基因表达调控。利用分子遗传学的基本理论指导相关科研工作。教学组织：教师讲述和学生自学结合。成绩评价：课程论文（50%）；按指定题目在规定时间内完成。闭卷考试（50%）。参考书籍：分子遗传学。南京大学分子遗传学，张玉静95年以后出版的分子生物学教材或专著第一章

遗传的物质基础――DNA

DNAisthegeneticmaterial一、DNA所带的遗传信息作为遗传物质所应具备的条件多样性贮存并表达多种遗传信息连续性准确传递后代稳定性物理、化学性质稳定多变性有遗传变化的能力DNA是遗传物质的证明1928年Griffith的肺炎球菌对小鼠的转化1944年Avery对肺炎球菌的转化1952年病毒重组真核细胞的基因转化1953年Watson和Crick，DNA双螺旋模型

核酸之外的遗传物质克雅氏病－－1913库鲁病（kuru）－－1950羊搔痒病（scrapie）－－1959疯牛病－－1985共同特征：退行性神经疾病，影响大脑功能，大脑细胞死亡。过滤性因子，可感染，能被蛋白质酶灭活，但不能被核酸酶或UV灭活，朊病毒（prion），即蛋白质样的感染粒子遗传信息负责蛋白质氨基酸组成的信息――结构基因基因选择性表达的信息――调控基因高等生物的结构基因占基因组的10-15%，占基因组80%以上的DNA有什么作用？无准确的回答。与基因表达的调控有关。AGTC3-5磷酸二脂键三、DNA的二级结构Watson-Crick的DNA双螺旋的特征主链右手双螺旋，脱氧核糖和P为骨架，位于外侧，反向平行螺旋,直径￠2nm碱基配对位于内侧，嘌呤和嘧啶（A-T,G-C）螺旋参数任一条链绕轴一周的升降的距离。3.4nm，10对核苷酸，相邻碱基0.34nm。大沟和小沟骨架双链在螺旋轴上的间距不等，在DNA表面形成宽窄不等的大小沟。大沟宽2.2nm，是蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息位点。小沟宽1.2nm。决定双螺旋稳定的因素1、氢键结构的稳定性与G+C的含量成正比，G-C>A-T.2、碱基堆积力嘌呤和嘧啶具疏水性,产生疏水区而与介质分开,使碱基与水的接触为最小。3、其他带负电荷的磷酸基与介质中的阳离子形成离子键,可有效地屏蔽磷酸基间的静电斥力。

四、DNA物理结构的不均一性富含A+T的序列AT含量在染色体的不同区域不同，螃蟹卫星DNA的AT含量高达97%。AT区域对复制和转录的起点很重要。嘌呤和嘧啶的排列顺序碱基组成相同，但排列不同，双螺旋的稳定性有差别5’GC>5’CG，和碱基堆积力有关，碱基堆聚力是嘌呤向嘧啶方向大于嘧啶向嘌呤方向。Tm值，DNA熔解温度双螺旋失去一半时的温度，GC含量与Tm成正比。Tm值低的双链容易解开，复制起点的核苷酸多为TA反向重复序列回文序列（palindrome）形成发夹结构，十字形结构，是限制酶的酶切位点。B－DNA天然状态DNA，相对湿度92％。右手双螺旋，每周螺旋10对碱基(10.4)，螺距3.4nm，碱基平面与螺旋轴垂直，大沟宽而深。Z－DNA左手双螺旋，每圈螺旋12对碱基，螺距4.6nm，碱基平面与螺旋轴不垂直，无大沟，小沟深而窄

一条嘌呤和两条嘧啶链构成，(YR*Y)CG*C，TA*T星号左边的碱基正常配对，右边的碱基异常配对或两条嘌呤和一条嘧啶链构成(YR*R)CG*G，TA*A，CG*A。GGGACAATC六、DNA的变性和复性变性：热，试剂，氢键、碱基堆积力破坏，DNA由双链变成单链温度：80～100℃变性剂：尿素，甲酰胺增色效应（hyperchromicity）正常双链（50μg/ml）A260=1.00完全变性的单链DNAA260=1.37单核苷酸A260=1.60DNA双螺旋结构失去一半时，A260=1.185Tm值的影响因素：DNA的均一性均一性高，Tm值的范围小G-C含量G-C含量高，Tm值高经验公式G-C%=(Tm-69.3)×2.44介质中的离子强度

低离子强度易熔解变性

DNA保存在高浓度缓冲液中防变性（TE）

复性单链重新缔合为双螺旋的过程，一般比Tm低20～25℃下进行复性过程：复性时溶液中单链DNA随机碰撞。GC先配对形成短的双链，然后配对区域延伸，象拉链一样复性产生的不一定是原有的互补链，非原配影响DNA复性的因素：DNA复杂性简单序列复性快DNA浓度高浓度复性快DNA片断片断小复性快，移动碰撞机会多温度过低温度减少互补链的碰撞机会盐浓度过低盐浓度使复性后的DNA又变性杂交：不同来源的单链核酸经碱基互补配对而形成的双螺旋，DNA-DNA,DNA-RNADNA杂交可反映不同生物中DNA的共同序列和不同序列，研究生物的进化，

核酸杂交是现代分子生物学的基础液相杂交滤膜杂交Cot曲线DNA复性时的单链消失的速度1C/Co=――――1+KCotC：单链DNA浓度，Co：DNA总浓度，t：时间秒，k：=二级反应常数复性的分数C/Co是起始浓度和经过时间的乘积（Cot）的函数。

Cot曲线定义C/Co=1/2时，Cot值定义为Cot1/2；即复性一半时DNA总浓度和时间乘积11/2=――――――1+Kcot1/21+KCot1/2=2Cot1/2=1/k不同DNA的Cot1/2值不同，总DNA浓度相同时，片断越短，Cot1/2值越小，DNA复杂性越高，复性越慢，基因组大复性慢.DNA复杂性（X）：最长的没有重复序列的DNA核苷酸对的数值：ATATAT---,X=2ATGC------,X=4

X=KCot1/2七、DNA超螺旋结构生物体中大多数DNA是以超螺旋的形成存在，而缺少超螺旋的DNA则为松弛型DNA原核生物DNA，共价封闭环，再经螺旋就成为超螺旋真核生物DNA为线性，DNA与蛋白质结合之间的DNA可形成一个小“环”，类似共价封闭环，从而螺旋成为超螺旋正超螺旋：和DNA内部双螺旋缠绕方向相同的方向缠绕形成的超螺旋，结构更加紧密。DNA每圈初级螺旋的碱基对小于10.5，则为正超螺旋。

负超螺旋：DNA绕其轴与右手双螺旋方向相反的方向缠绕所产生的超螺旋，结果减少每个碱基对的旋转，每圈初级螺旋的碱基对大于10.5，则为负超螺旋。超螺旋是耗能过程，超螺旋的产生可能为能量的储存形式拓扑异构酶Ⅰ催化DNA链断裂和重新连接。每次只作用于一条单链，无需ATP，功能是松弛DNA，代表：

E.coli拓扑异构酶Ⅰ，对单链DNA的亲和力比双链高，能识别负超螺旋区，使负超螺旋扩大化而成松弛状，该酶不能松弛正超螺旋真核生物拓扑异构酶Ⅰ可结合15-19核苷酸的双链区域,其断裂点在此区域中间.该酶倾向于结合超螺旋而不是结合松弛DNA区域,对正负超螺旋都有松弛功能.拓扑异构酶Ⅱ

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅱ又称DNA旋转酶(DNAgyrase)，能催化断裂和连接双链DNA，需能量ATP参与，无碱基序列特异性，

DNA旋转酶结合到双链闭环分子中在ATP的作用下产生负超螺旋。无ATP时只能缓慢松弛负超螺旋而不能松弛正超螺旋。大肠杆菌拓扑异构酶Ⅱ主要功能是引入负超螺旋以抵消复制叉移动所产生的正超螺旋，还具有形成或拆开双链DNA环连体的能力。该酶对DNA的结合顺序是正超螺旋>松弛>负超螺旋拓扑异构酶的生物学功能

恢复细胞过程产生的DNA超螺旋，如复制叉前的正超螺旋、转录时聚合酶前产生的正超螺旋。防止细胞DNA过度超螺旋，维持超螺旋的稳定水平。生物体内5％负超螺旋，有利于基因的转录、基因组稳定、促进重组。去连环活性（大肠杆菌）、染色体凝缩（真核）、解开缠绕DNA双螺旋

拓扑异构酶的催化反应本质是先切割DNA的磷酸二脂键，改变DNA链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能，但是它不能连接事先已经存在的断裂DNA，是DNA复制、重组和转录中必需的酶

八、常见DNA分子形式及相互关系

沉降系数：Cscl密度梯度离心时的表示单位。Cscl本身有梯度，在离心时将不同分子大小的物质集中到它自身的不同梯度中。

在同一种密度梯度离心条件下，沉降系数大表示易沉淀，则具有较高的超螺旋。鉴定DNA超螺旋的手段。

Ⅰ型DNA具正、负超螺旋的双链环状DNAS＝1.41Ⅰ°型DNA无超螺旋的双链环状DNA，是松弛型S=1.14Ⅱ型DNA一条链或两条链上有一个或几个切口的双链环状DNAS=1.14Ⅲ型DNA线形双链DNA