微生物多样性分析堆肥

微生物多样性分析堆肥第1页，共30页，2023年，2月20日，星期四主要内容

微生物多样性简介微生物多样性研究方法综述多样性测序案例第2页，共30页，2023年，2月20日，星期四环境微生物微生物数量最多、范围最广元素循环与微生物相互作用

了解各系统中微生物的组成、掌握系统的能量代谢及发挥的功能至关重要第3页，共30页，2023年，2月20日，星期四多样性研究手段发展史454(2005)Illumina(2006)Miseq(2011)19901960DGGET-RFLPClonelibrary高通量时代分子生物学手段Pacbio(2009)单菌分离培养第4页，共30页，2023年，2月20日，星期四测序原理454Miseq第5页，共30页，2023年，2月20日，星期四高通量研究多样性技术路线第6页，共30页，2023年，2月20日，星期四

DNA质检：检测DNA质量及浓度预实验：摸索PCR条件，尽量用最少的循环数扩增，减少PCR扩增对样品丰度的影响。同时将各个样品起始模板量均一化正式实验：使用高保真酶，最大程度的减少PCR过程引入的碱基变化。每个样品经历3个批次的PCR扩增，降低偶然误差带来的影响。使用双barcode进行上机测序。精确定量：精密仪器加上多年积累的经验，保证后期数据产出的均一性（我们的承诺）第7页，共30页，2023年，2月20日，星期四测序完要做哪些分析？第8页，共30页，2023年，2月20日，星期四土壤建议土钻法，按“S”型选取6点土样，混合均匀后分装于封口试管中，液氮固定，-80℃保存。水体

建议采集底泥，或滤膜样本，混合均匀后分装于封口试管中，液氮固定，-80℃保存。常见问题如何取样第9页，共30页，2023年，2月20日，星期四常见问题样本量？横坐标：样品量；纵坐标：抽样后OTU数目。利用物种累积曲线可以作为对样品量是否充分的判断，曲线急剧上升表明样品量不足，需要增加抽样量；反之，则表明抽样充分，可以进行数据分析。Specaccum物种累积曲线第10页，共30页，2023年，2月20日，星期四常见问题样品来源测序量(细菌)参考文献土壤1-2万pnas,2013,110(16)6548–6553.水样>1万TheISMEJournal(2013)7,210–220沉积物>1万MarinePollutionBulletin72(2013)181–187测序量稀释性曲线（Rarefactioncurve）第11页，共30页，2023年，2月20日，星期四可变区引物与16S全长比对结果V1-V28F-338R高估V6967F-1046R高估V3338F-530R低估V71046F-1220R低估V7-V81046F-1392R低估V4530F-805R接近V5-V6805F-1046R接近V6-V7967F-1220R接近Youssef,N.etal.Comparisonofspeciesrichnessestimatesobtainedusingnearlycompletefragmentsandsimulatedpyrosequencing-generatedfragmentsin16SrRNAgene-basedenvironmentalsurveys.Appliedandenvironmentalmicrobiology75,5227–5236(2009)该选取哪个测序区域？常见问题第12页，共30页，2023年，2月20日，星期四Effectsofnanoscalezero-valentironparticlesonbiologicalnitrogenandphosphorusremovalandmicroorganismsinactivatedsludge期刊名称：JournalofHazardousMaterialsIF：9.267发表时间：2013不同浓度纳米粒子对活性污泥中微生物群落组成的影响第13页，共30页，2023年，2月20日，星期四测序平台：454pyrosequencinganalysis测序区域：16SV1~V3区取样：活性污泥+50mL合成废水以及NZVI颗粒（后者浓度分别设为0，20，50和200mg/L，其中0作为对照），最终体积为200mL。实验设计第14页，共30页，2023年，2月20日，星期四NZVI颗粒对细菌群落组成的影响物种组成第15页，共30页，2023年，2月20日，星期四PCA结果高浓度NZVI处理组与对照组的微生物群落结构存在差异PCA分析第16页，共30页，2023年，2月20日，星期四多样性分析要回答的问题

单个物种（"single"species）丰度在不同样品中是否有差异?微生物群落结构（community"structure"）在不同组样品间是否有差异？某些环境因子（environmental"variables"）是否能解释这些差异?第17页，共30页，2023年，2月20日，星期四单个物种丰度在不同样品中是否有差异?群落结构组分柱状图群落Heatmap图Venn图第18页，共30页，2023年，2月20日，星期四微生物群落结构在不同组样品间是否有差异？PCA分析NMDS分析多样品比对树状图Cytoscape关联分析3D-PCoA分析第19页，共30页，2023年，2月20日，星期四单个物种丰度在不同样品中是否有显著差异?LEfSe分析Metastats分析第20页，共30页，2023年，2月20日，星期四宏基因组研究基因组DNA高变区测序功能注释及功能分类基因预测代谢通路比较基因组学分析串联组学物种分类物种丰度系统进化广义：特定环境下所有生物遗传物质的总和。狭义：生态环境中全部细菌和真菌基因组。第21页，共30页，2023年，2月20日，星期四宏基因组测序平台的选择环境样品基因组DNA构建SE文库emPCR454测序片段化方案2片段化构建PE文库构建MP文库桥式PCRMiSeq测序HiSeq测序方案1可选第22页，共30页，2023年，2月20日，星期四分析流程与策略组成分析差异分析关联分析网络分析进化分析Read-based

metagenomeAssemble-based

metagenome第23页，共30页，2023年，2月20日，星期四分析内容COG注释KEGGGO注释第24页，共30页，2023年，2月20日，星期四MetagenomicAnalysisofaTropicalCompostingOperationattheSa˜oPauloZooParkRevealsDiversityofBiomassDegradationFunctionsandOrganisms

期刊名称：PlosOneIF：9.267发表时间：2013不同时期堆肥微生物的变化及生物降解过程发挥的功能第25页，共30页，2023年，2月20日，星期四样品选择：

Sa˜oPauloZooParkcompostingfacilityZC1样品采自堆肥开始的第8天，65.8℃，pH7.0ZC2样品采自堆肥开始的第60天，67.2℃，pH7.0

测序平台：

Roche454GSFLX实验设计第26页，共30页，2023年，2月20日，星期四ZC1样品中含量最丰富的门是ProteobacteriaZC2样品中含量最丰富的门是Firmicutes物种组成第27页，共30页，2023年，2月20日，星期四

物种组成第28页，共30页，2023年，2月20日，星期四样品ZC1和ZC2中片段所注释到的COG功能相似，但是样品ZC1降解纤维素的能力要比样品ZC2强。COG