抗体技术研究及产业化

抗体技术研究及产业化第1页/共88页

第2页/共88页细胞表面抗原血型抗原组织相容性抗原白细胞分化抗原CD2CD3CD25CD10CD20CD38CD45CD71CD41CD42CD8...第3页/共88页肿瘤相关抗原胃癌肺癌肝癌鼻咽癌大肠癌宫颈癌乳腺癌结肠癌卵巢癌胰腺癌喉癌脑胶质瘤骨肉瘤第4页/共88页病毒HFRSV新城疫甲肝轮状登革乙肝RSV乙脑流感马雅罗Mayaro

基孔贡亚ChikungunyaRossRiver罗斯河

盖塔Getah柯萨奇狂犬新培斯Sindbis第5页/共88页细菌大肠杆菌沙门氏菌痢疾杆菌军团杆菌结核杆菌绿脓杆菌麻风杆菌霍乱弧菌第6页/共88页寄生虫血吸虫疟原虫弓形虫旋毛虫丝虫毛滴虫绦虫利什曼原虫第7页/共88页可溶性抗原酶血浆蛋白毒素细胞因子补体激素小分子化合物第8页/共88页

抗体技术的研究和抗体的研发，是生物技术发展的永恒主题抗体广泛用于临床疾病的诊断和研究目前在美国单克隆抗体类药物已占FDA所批生物药的3/4第9页/共88页第10页/共88页第一章抗体类型和抗体技术发展第11页/共88页

第一代多克隆抗体第二代单克隆抗体第三代基因工程抗体第四代全人抗体？第12页/共88页鼠源单抗临床应用的障碍●

血清半衰期短，20h●抗原抗体结合力、亲和力不够●募集效应细胞产生副作用●

HAMA反应：8－10天出现，20－30天高峰，anti-id封闭与抗原结合位点，抗鼠抗体加速单抗清除●过敏性休克第13页/共88页影响单抗与靶细胞或抗原结合引起变态反应和器官损害HAMA反应示意图第14页/共88页第15页/共88页

第一代多克隆抗体第二代单克隆抗体第三代基因工程抗体第四代全人抗体？第16页/共88页小鼠抗体嵌合抗体重构抗体人源抗体鼠100%33%10%0人067%90%100%第17页/共88页

第一代多克隆抗体第二代单克隆抗体第三代基因工程抗体第四代全人抗体？第18页/共88页小鼠抗体嵌合抗体重构抗体人源抗体鼠100%33%10%0人067%90%100%第19页/共88页♣人—鼠嵌合抗体♣改型抗体（又称人源化抗体）♣小分子抗体♣双特异抗体♣抗体融合蛋白基因工程抗体的类型第20页/共88页1、嵌合抗体

将人IgC区与鼠IgV区相连接，从而在同一抗体分子中含有不同属来源的抗体。

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构建嵌合抗体的基本原理，从杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因相连接，插入适当的载体中，构建成人—鼠嵌合的重链和轻链基因，然后共转染骨髓瘤细胞，使之表达嵌合抗体。第22页/共88页表1FDA批准上市的单克隆抗体药物产品研究者适应症目标抗原批准年份抗体类型ReoproCentocor心血管疾病IIIαIIIβ1994嵌合抗体RituxanIDEC非霍奇金氏淋巴癌CD201997嵌合抗体RemicadeCentocor类风湿关节炎TNF-α1999嵌合抗体SimulectNovartis肾脏移植CD251998嵌合抗体第23页/共88页2、改型抗体应用CDR移植技术，即将鼠单抗V区中互补决定区（CDR）序列取代人源抗体相应CDR序列，重构成既具有鼠源性单抗特异性，又保持人抗体亲和力的CDR移植抗体（CDR-graftedAb），也称为改型抗体或人源化抗体。第24页/共88页表1FDA批准上市的单克隆抗体药物产品研究者适应症目标抗原批准年份抗体类型SynagisMedimmune呼吸道感染Fprotein1998人源化抗体ZenapaxPDL肾脏移植CD251997人源化抗体HerceptinGenentech乳腺癌HER2/neu1998人源化抗体MylotargCelltech白血病CD332000人源化抗体CampathMillennium淋巴瘤CD522001人源化抗体XolairGenentech中度至严重的因敏感引起的哮喘IgE2003人源化抗体HerceptinGenentech乳腺癌HER22006人源化抗体第25页/共88页

3、小分子抗体

利用细菌表达决定抗体特异性的结构域，所获抗体片段大小仅为IgG分子的1/3-1/12，因此称之为小分子抗体。第26页/共88页小分子抗体包括：

Fab1/3Fv1/6ScFv1/6

单域抗体1/12MRU

第27页/共88页Fab片段

Fab片段由重链VH加CH1及完整的轻链构成，在细菌的启动子控制下，在大肠杆菌中表达而合成Fab，大小为完整抗体的1/3，其结构与木瓜蛋白酶消化完整抗体后所产生的Fab片段一致。用DNA重组技术制备的嵌合Fab片段，其V区为鼠源性，而CH1、Cκ为人源性的。第28页/共88页FV片段

FV片段由VH和VL组成，是抗体的抗原结合部位，分子量只有完整分子的1/6。采用共价结合的FV片段，在不改变其分子大小的情况下，可避免VH或VL的解离。

第29页/共88页第30页/共88页单域抗体和最小识别单位

单域抗体是指VH或VL，其分子大小仅为完整抗体的1/12。由单个CDR构成的小分子抗体称为最小识别单位（MRU）。第31页/共88页

单链抗体单链抗体分子是由一条单一肽链按VH-Linker-VL

或VL-Linker-VH

的顺序组成。分子大小是完整抗体分子的1/6，ScFv是抗体与抗原结合的最小单位。第32页/共88页ScFv具有以下特点：●具有与原亲本抗体相同的特异性和亲和力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整抗体不易到达靶细胞、清除慢和易引起超敏反应及组织损伤等缺点；●制备流程较其他基因工程抗体简单，可由大肠杆菌发酵产生；第33页/共88页

●

无Fc段，所以减少了与非靶细胞上Fc受体结合，使其更特异性集中于靶细胞部位，有利于作为载体用于药物的导向治疗；

●易进行分子改造，ScFv基因片段还可以与适当的酶基因或毒素蛋白基因重组，转入适当的表达系统，可产生出酶联抗体或具有与抗原结合特异性和细胞毒性的重组免疫毒素。

第34页/共88页4.双特异抗体(bispecificantibody,BsAb)

一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原决定簇。第35页/共88页制备：化学偶联技术基因工程技术二次杂交瘤技术第36页/共88页在导向治疗中的应用药物导向

肿瘤细胞抗原BsAb

效应物（细胞毒素等）细胞导向

肿瘤细胞抗原BsAb效应细胞（CTL、LAK等）第37页/共88页双特异性抗体

抗人肝癌单抗/抗人CD3单抗抗Her2/neu单抗/抗人CD16单抗抗人CD20单抗/抗人CD3单抗

抗人卵巢癌单抗/抗人CD3单抗第38页/共88页

5.

抗体融合蛋白和免疫毒素将编码抗原结合部位的基因片段（Fab或Fv段）与毒素或酶的基因融合在一起，可将特定的生物活性物质导向特定部位。第39页/共88页

抗体融合蛋白

抗人卵巢癌单抗-IL-12血吸虫病抗独特型抗体-IL-12第40页/共88页表1FDA批准上市的单克隆抗体药物产品研究者适应症目标抗原批准年份抗体类型EnbrelImmunex类风湿关节炎TNF-α1998抗体融合蛋白AlefaceptBiogen银屑病CD22003抗体融合蛋白第41页/共88页

重组免疫毒素借助DNA重组技术，将编码抗体和毒素的基因连接在一起，产生的免疫毒素为重组免疫毒素。白喉毒素相思豆毒素假单胞菌外毒素优点：高效、非特异性毒性较低、体内稳定性较好、易穿透肿瘤、安全第42页/共88页

全人抗体的研究

鼠-人杂交瘤人-人杂交瘤转人Ig基因组小鼠抗体库技术非杂交瘤技术制备单抗第43页/共88页

通过基因转染方法改良鼠骨髓瘤细胞，筛选稳定的鼠-人嵌合细胞，使融合的杂交瘤细胞遗传性稳定，不易丢失染色体，可长期、稳定地分泌全人单克隆抗体。鼠-人杂交瘤技术第44页/共88页

鼠-人杂交瘤技术问题：鼠源成分残留稳定性差染色体丢失第45页/共88页

人-人杂交瘤技术

问题：能稳定分泌抗体的亲本细胞很难获得稳定性差染色体易丢失第46页/共88页

人-人杂交瘤技术英国剑桥大学KarpasA(2001)报道建立了人-人杂交瘤技术，获得Karpas707H人骨髓瘤细胞株，可制备全人抗体。第47页/共88页

转入人的Ig基因组免疫动物全人抗体基因敲除小鼠转人Ig基因组小鼠第48页/共88页抗体库技术

基础：

PCR技术的建立抗体分子在大肠杆菌的功能性表达噬菌体展示技术的发展第49页/共88页

抗体库的种类：

●

初期的抗体库

●噬菌体抗体库

●大容量抗体库第50页/共88页

人淋巴细胞抗原筛选产生特异克隆

RT-PCR

轻链重链基因转印至NCDNA重组组合抗体库E.coli随机表达1.初期抗体库第51页/共88页

噬菌体抗体（phageantibody）是将克隆的人AbV区基因与一种丝状噬菌体DNA上的基因-Ⅲ或基因Ⅷ精确连接，转染细菌后在其膜表面表达Fab段（或单链抗体）-噬菌体外壳蛋白（基因-Ⅲ或基因Ⅷ产物）的融合蛋白。2.噬菌体抗体库第52页/共88页

这种噬菌体在一定意义上讲相当于一个人B细胞克隆，将B细胞全套可变区基因克隆出来与噬菌体DNA相连，导入细菌体内使之表达，可制备人全套抗体，称为噬菌体抗体库。第53页/共88页

问题：

1、从未经免疫动物的抗体库获得的抗体其亲和力不高

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抗体体内生成的理论

抗原刺激前，机体具有抗体初级库抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。在抗原的反复刺激下，抗体的V区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。第55页/共88页抗体亲和力改造链替换(ChainShuffling)计算机辅助设计下的定点突变高亲和力克隆的选择第56页/共88页2、抗体库的库容不足以涵盖某种动物的抗体多样性

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3.大容量抗体库???

天然抗体库半合成抗体库全合成抗体库第58页/共88页

抗体库的优点：

1.多数外源抗原对人体有害，不能随意对人体进行免疫。噬菌体抗体无须免疫，可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选针对该物种自身抗原的抗体；

2.轻、重链随机组合的多样性多于供体B细胞产生抗体的多样性，构建一种噬菌体抗体文库，可供产生针对多种特异性抗原的人源抗体，从而克服了难以建立人-人杂交瘤的困难；

3.细菌增殖快，培养成本低廉，适合工业化大规模生产，为临床大量应用抗体提供了可能。第59页/共88页

总抗体库（masterlibrary）人们将有望在原核系统模拟体内免疫过程，并任意克隆针对任何抗原的抗体。第60页/共88页

非杂交瘤技术制备单抗人B淋巴细胞转染EB病毒及生长因子B细胞永生化第61页/共88页

Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的抗体药物，2002年上市，是完全人源化单抗，这是抗体药物发展具有里程碑意义大事，预示着抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。2003年有4亿美元的销售额，2005年达到11亿美元。Avastin2003年上市的治疗结肠癌的抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的Fab段抗体药物。Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。第62页/共88页第二部分抗体的应用及产业化研究第63页/共88页单克隆抗体的应用基础研究预防治疗诊断第64页/共88页♣

抗体是生化、免疫学、生物芯片等多种诊断试剂中的核心生物原料，在各种疾病的诊断领域具有广泛的用途。我国目前用于临床诊断方面的抗体80%

依靠进口。国外已批准的诊断性单抗有600多种，我国仅60余种。单克隆抗体用于诊断第65页/共88页单克隆抗体用于疾病诊断传染病诊断肿瘤诊断免疫性疾病诊断内分泌疾病诊断血液病诊断第66页/共88页♣心脑血管疾病、肿瘤、神经退行性疾病、传染病、自身免疫性疾病和内分泌性疾病等日益威胁着人类的健康。针对这些重要疾病，要不断研究和开发新的治疗药物。虽然化学药物一直占据主流地位，但抗体药物导向性强、副作用小、半衰期长等优势吸引了越来越多的投资。单克隆抗体用于治疗第67页/共88页单克隆抗体用于疾病治疗肿瘤自身免疫性疾病器官移植心血管疾病感染性疾病第68页/共88页表1FDA批准上市的单克隆抗体药物产品研究者适应症目标抗原批准年份抗体类型PanorexCentocor肿瘤17-1A1995鼠源抗体OthocloneOrthoBiotech异体移植CD31986鼠源抗体ReoproCentocor心血管疾病IIIαIIIβ1994嵌合抗体RituxanIDEC非何杰奇金斯淋巴癌CD201997嵌合抗体RemicadeCentocor类风湿关节炎TNF-α1999嵌合抗体SimulectNovartis肾脏移植CD251998嵌合抗体EnbrelImmunex类风湿关节炎TNF-α1998抗体融合蛋白SynagisMedimmune呼吸道感染Fprotein1998人源化抗体ZenapaxPDL肾脏移植CD251997人源化抗体HerceptinGenentech乳腺癌HER2/neu1998人源化抗体MylotargCelltech白血病CD332000人源化抗体CampathMillennium淋巴癌CD522001人源化抗体ZevalinIDEC淋巴癌CD20-Y902002鼠源抗体HumiraAbbottLaboratories类风湿关节炎TNF-α2002人抗体XolairGenentech中度至严重的因敏感引起的哮喘IgE2003人源化抗体AlefaceptBiogen银屑病CD22003抗体融合蛋白第69页/共88页

美国已上市18种单克隆抗体药物

2002年销售额29亿美元

2003年40亿美元

2005年90亿美元

2008年150亿美元

2010年300亿美元第70页/共88页

2002年完全人源化单抗humira获得批准上市，这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事。Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物，2003年有4亿美元的销售额，2005年达到11亿美元。第71页/共88页

Avastin

是美国FDA批准的治疗结肠癌的抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的Fab段抗体药物。Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。第72页/共88页

赫赛汀（英文名Trastuzumab），抗人表皮生长因子受体-2(HER-2)的人源化单克隆抗体，用于治疗转移性乳腺癌。有25%-30%原发性乳腺癌患者HER2过度表达。第73页/共88页

抗体药物临床应用广泛，市场需求巨大。抗体药物已占FDA批准生物技术药的3/4，所有新研发药物的1/3。第74页/共88页我国治疗用抗体的研制现状第75页/共88页中国仅有3个治疗性单抗药物获准上市抗乙脑中和抗体（鼠源）肺癌治疗性抗体（嵌合抗体）肝癌治疗性抗体（鼠源片断）第76页/共88页血吸虫病治疗性抗体狂犬病治疗性抗体禽流感治疗性抗体鼻咽癌治疗性抗体肝癌治疗性抗体第77页/共88页♣抗独特型抗体疫苗（anti-idAbvaccine）

单克隆抗体用于预防第78页/共88页