-蛋白质化学优秀公开课

第一章蛋白质化学第一节蛋白质通论第二节氨基酸第三节肽第四节蛋白质的分子结构第五节蛋白质分子结构与功能的关系第六节蛋白质的重要性质与分离纯化本章重点与难点、思考题1第一节蛋白质通论二蛋白质的分类1按组成成分分2按功能分3按外形分一蛋白质化学组成三蛋白质的大小四蛋白质功能的多样性2一蛋白质(protein)的化学组成1化学组成：C:50%，H:7%,O:23%,

N:16%，S:0-4%,其它:微量

2凯氏定氮法:蛋白质含量%=蛋白氮含量×6.253◆结合蛋白质:除氨基酸外,还含有非蛋白质成份,即辅基.

核蛋白:含核酸,核糖体

脂蛋白:脂质,卵黄球蛋白

糖蛋白:糖,辣根过氧化物酶

磷蛋白:磷酸基,胃蛋白酶

血红素蛋白:血红素(卟啉素类化合物),细胞色素C

黄素蛋白:FAD,FMN,如琥珀酸脱氢酶

金属蛋白:乙醇脱氢酶(Zn)52按功能分◆催化作用(酶):淀粉水解酶◆运输蛋白:血红蛋白、铁氧还蛋白、离子泵◆贮藏蛋白:酪蛋白、卵清蛋白◆收缩蛋白(运动):肌动和肌球蛋白、纤毛蛋白,◆防御蛋白:免疫球蛋白(抗体)、干扰素◆结构蛋白:角蛋白(毛发)、胶原蛋白、膜蛋白◆调节蛋白:钙调素、胰岛素、生长激素、阻遏蛋白63按外形和溶解度分:

◆纤维状蛋白质:

有规则的线性结构、细棒或纤维状。

主要起结构作用。

不溶于水(如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白).有些(如肌球蛋白)是可溶性的。◆球状蛋白

球形或椭球形，亲水侧链在外部暴露于水溶剂。

细胞内大多数可溶性的蛋白质均为球形蛋白。如血红蛋白.7醇溶蛋白(prolamines)：不溶于水和盐溶液，溶于70%～80%的乙醇，多存在于禾本科作物的种子中，如玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白。谷蛋白类（glutelins）：不溶于水、稀盐溶液，溶于稀酸和稀碱。谷蛋白存在于植物种子中，如水稻种子中的稻谷蛋白和小麦种子中的麦谷蛋白等。硬蛋白类（scleroproteins）：硬蛋白不溶于水、盐溶液、稀酸、稀碱，主要存在于皮肤、毛发、指甲中，起支持和保护作用，如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白等。9三蛋白质的大小与分子量

20种氨基酸的平均相对分子量为128。氨基酸残基的平均分子量为128-18=110。故不含辅基的简单蛋白质,用110除它的分子量即可略估计其氨基酸的数目。10蛋白质的分子量通常在10—1000kD

道尔顿就是原子质量单位，在生物化学、分子生物学和蛋白组学中经常用D或KD，定义为碳12原子质量的1/12，1D＝1/Ng，N为阿弗加德罗常数，如水的分子量为18道尔顿116运输功能—血红蛋白和肌红蛋白运输氧，离子通道和载体蛋白、铁氧还蛋白传递电子；7激素和神经的受体蛋白—接受和传递信息；8细胞调控蛋白—染色质、阻遏蛋白、转录因子等参与基因的表达调控，细胞周期蛋白调控细胞的分裂、增殖、生长和分化；9种子贮藏蛋白、酪蛋白等具有贮藏氨基酸和蛋白质的功能。10糖蛋白。11其它特殊功能蛋白：毒素蛋白、味觉蛋白等13第二节氨基酸(aminoacid)一蛋白质的水解(自学)二氨基酸三氨基酸的理化性质1两性解离与等电点2分类3不常见的蛋白质氨基酸4非蛋白质氨基酸2光学性质3化学反应1蛋白质氨基酸14一蛋白质的水解(自学)◆完全水解(产物为氨基酸)、不完全水解(肽段和单个氨基酸)15二氨基酸

生物体氨基酸的多样性◆180多种，可分为蛋白质氨基酸(20种)、非蛋白质氨基酸◆含有氨基和羧基◆构型有两种：D型，L型。生物体内氨基酸大多是L-型的，极少数为D型。17◆α-碳原子上都有一个α-氨基和α-羧基。◆除脯氨酸为亚氨基外,其它氨基酸均为α–氨基酸,L-α–氨基酸

1蛋白质氨基酸◆除Gly外，都有一个不对称碳原子，因而具有旋光性。18192蛋白质氨基酸分类按R基团的极性(pH7.0)可将蛋白质的氨基酸分为四类:非极性氨基酸:8种极性氨基酸：不带电荷的氨基酸:7种负电荷的氨基酸：2种正电荷的氨基酸：3种21◆非极性氨基酸:8种22吲哚环吡咯环23252629◆R基团带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸):3种赖氨酸、精氨酸、组氨酸咪唑基胍基30◆Lys、Arg、His侧链基团在pH7.0时带有正电荷。Lys的R侧链带有-NH2基，Arg带有具正电荷的胍基，His具有弱碱性的咪唑基。31◆脂肪族氨基酸

一氨基一羧基的中性氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile

含羟基的氨基酸:Ser,Thr

含硫氨基酸:Met,Cys

含酰胺基的氨基酸:Asn,Gln

含一氨基二羧基的酸性氨基酸:Asp,Glu

含二氨基一羧基的碱性氨基酸:Arg,Lys,◆芳香族氨基酸:Phe,Tyr，Trp◆杂环族氨基酸:His,Pro

小结32第21种天然氨基酸：1986年，英国的Chamber和德国的Zinoni等,硒代半胱氨酸Se-Cys(Selenocysteine)，由终止密码子的(UGA)编码第22种天然氨基酸：2002年,美国的Srinivasan和Hao等,吡咯赖氨酸(pyrrolysine)，由终止密码子(UAG)编码33343不常见的蛋白质氨基酸:由相应的常见氨基酸经修饰而来。4-羟脯氨酸(Hyp):5-羟赖氨酸:4非蛋白质氨基酸:D-aa(如D-Phe,D-Glu),β-aa(β–氨基丁酸,β-丙氨酸)γ-氨基丁酸(神经递质)茶氨酸、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit):35363738三氨基酸的理化性质1氨基酸的两性解离和等电点◆氨基酸同一分子中含有-NH2和COOH、-COOH可电解出H+变成-COO-、-NH2接受H+变成正离子。氨基酸在水溶液中和结晶形式存在时都是以两性离子(兼性离子、偶极离子)形式存在。◆依照酸碱质子理论(Bronsted-Lowry),酸是质子的供体,碱是质子的受体,故氨基酸是两性电解质。

3940◆丙氨酸：氨基酸的解离

在酸性条件下,丙氨酸以阳离子形式存在,可以看作是一个二元弱酸,有两个可以解离的H+,即-COOH上的H+和NH3+上的H+。它的分解步骤如下:41pH=pK1'+lg[Ala/Ala+]pH=pK2'+lg[Ala-/Ala]pH=pK1'+lg[质子受体/供体]42

表观解离常数：常用测定滴定曲线的方法求得。

当1mol丙氨酸溶于水时,pH=6.02。用氢氧化钠滴定,得曲线B。在pH9.69处有一拐点,即pK2′。在此,阴离子浓度与两性离子浓度相等,K2′=[H+]。

用标准HCl滴定时得曲线A,在pH2.34处有一拐点,即pK1′。在此,正离子浓度与两性离子浓度相等.K1′=[H+]

43随酸性增强，丙氨酸两性离子(Ala)作为碱，接受H+转变为正离子(Ala+)。随着碱性增强，丙氨酸作为酸，其NH3+供出质子而转变为负离子(Ala-)。44◆等电点(isoelectricpoint)

加入酸碱在使得丙氨酸基本上都以两性离子形式存在，净电荷等于0时,这时的pH值就是丙氨酸等电点(pI)。即:两性电解质所带正负电荷相等，净电荷为0时的溶液pH值。

pI值为两性离子状态两侧的基团pK′值之和的一半。pI=(2.34+9.69)/2=6.02。45R+Ro+H+RoR-+H+4647◆酸、碱性氨基酸的pI的计算(自学)酸、碱性氨基酸侧链基团可以解离时，其表观解离常数用pKR′表示。

酸性氨基酸的pI计算：

48

-COOH解离先于侧链-COOH,先于-NH3+PI=(pK1′+pKR′)/2=(1.88+3.65)/2=2.77.4950

-COOH解离先于-NH3+、先于侧链NH3+。(His:咪唑基NH+先于-NH3+，pK=6.0)

PI=(pK2+pKR)/2=(9.17+6.00)/2=7.59

碱性氨基酸pI计算(自学)：515253◆氨基酸的PI等于两性离子状态两侧的基团pK’值之和的一半。

中性的AA的PI=(pK1+pK2)/21:-COOH,2:a-NH3+,

酸性氨基酸(Glu、Asp),PI=(pK1+pKR)/2R:侧链基团(-COOH或-NH3+）

碱性氨基酸(Arg、Lys、His),PI=(pK2+pKR)/2

中性氨基酸的等电点不是pH7,而都是小于7，在pH6.0左右,如Ala=6.02,Ser=5.68,因为Insummary氨基酸中羧基的解离度大于氨基的解离度。54◆溶液pH、氨基酸pI、带电间关系：

在pH低于等电点的溶液中(pH<PI),带正电。

在高于等电点的pH溶液(pH>PI),带负电。

在一定pH范围内,氨基酸溶液的pH值离pI愈远,氨基酸所带的净电荷愈大.◆在一定pH范围内,氨基酸溶液的pH值离pI愈远,氨基酸所带的净电荷愈大.◆Asp:2.77,Glu:3.22Lys:9.74,Arg:10.76,His:7.59552氨基酸的光学性质

◆生物体内组成蛋白质的氨基酸都是L-型,只在少数细菌细胞壁上发现D-型。◆除Gly以外,含有不对称碳原子,所有氨基酸具有旋光性(L:左旋)。

氨基酸的比旋光度是基本的物理常数之一,其值取决于氨基酸侧链,也受溶液pH值的影响。◆20种氨基酸都不能吸收可见光.56◆吸收紫外光。

Trp、Tyr、Phe含有苯环共轭双键系统,在紫外区显示特征的吸收光谱。蛋白质一般最大光吸收在280nm。因此可以用紫外法测定蛋白质含量。57259nm278nm279nmOthertextbook:257/275/280nm583氨基酸的化学反应:-氨基参加的反应α–羧基参与的反应α–羧基与α–氨基共同参与的反应59α-氨基参加的反应

与亚硝酸的反应测量氮气的体积可计算氨基酸的含量。

与酰化试剂的反应可用于氨基的保护。

烃基化反应可用于测定多肽链的氮末端氨基酸。

形成西佛碱的反应为转氨基反应的中间步骤。

脱氨基反应为氨基酸分解反应的重要中间步骤。60◆-氨基参加的反应

与亚硝酸反应:

-氨基与其它一级胺一样能与亚硝酸反应,生成相应的羟酸和N2↑(Pro除外)。

RCH(NH2)COOH+HNO2→RCH(OH)COOH+N2↑+H2O(N2一半来自氨基酸,一半来自HNO2)

在标准条件下测定生成的N2↑,计算氨基酸的量。

61

与酰化试剂反应:

-NH2与酰氯或酸酐在弱碱性溶液中作用时,氨基即被酰基化.

二甲氨基萘磺酰氯(DNS):由于DNS-aa有荧光，可用荧光分光光度计可快速检出,故常常用于蛋白质的N-未端氨基酸的鉴定6263

烃基化反应:-NH2上的一个氢原子可被烃基取代。▽Sanger反应：英国人Sanger：鉴定多肽N-未端的氨基酸,用以测定多肽或蛋白质的氨基酸排序。

2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中发生亲核芳环取代反应生成2,4-二硝基苯氨基酸。

DNP-多肽水解后,生成游离氨基酸,只有DNP仍连在N-末端氨基酸上(黄色，DNP-aa),它在有机溶剂中的溶解度与其它氨基酸有同,可以用乙醚将DNP-氨基酸提提取出，鉴定N-基酸的的种类和数量642,4-二硝基氟苯黄色65▽Edman反应,氨基酸与苯异硫氰酸酯(PITC，或异硫氰酸苯酯)在弱碱(pH8.3)下形成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-氨基酸)。在酸性条件(硝基甲烷中用甲酸处理，或无水HF)下,发生环化生成苯硫乙内酰脲(PTH-氨基酸,无色).用于多肽链N-未端氨基酸的测定。6667

脱氨基反应:氨基酸经氨基酸氧化酶催化脱去-氨基而变成酮酸。RCH(NH2)-COOH→RCH(O)-COOH

形成西佛碱反应:

氨基酸的-NH2能与醛类化合物反应生成弱碱,即西佛碱。它是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的中间产物.RCHO+NH2-CH(R)-COOH→RCH=N-CH(R)-COOH+H2O

68◆α–羧基参与的反应

成酯反应:与醇反应

成盐反应:与碱反应

成酰胺反应：氨基酸酯与氨作用即可形成氨基酸酰胺，为生物体储NH3主要反应.动、植物体内的Glu、Asn也可以这种反应形成。

脱羧反应:生物体内的氨基酸经脱羧酶作用放出CO2并生成相应的胺.69◆α–羧基与α–氨基共同参与的反应

茚三酮反应:

茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热,引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应,最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用,生成紫色物质。亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸Hyp)与茚三酮反应并不生成氨,而是直接生成黄色化合物.

成肽反应:一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基脱水缩合成肽.

7071第三节肽(peptide)一肽与肽键二肽的重要性质1酸碱性质2化学性质三天然存在的活性肽72一肽与肽键1一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基脱水缩合成肽,生成一个肽键(酰胺键)和一个二肽化合物。NH2CH2(R1)COOH+NH2CH2(R2)COOH→NH2(R1)CH2-CO-NH-CH2(R2)COOH2n个氨基酸缩合可生成n-1肽.十个以下的肽叫寡肽，超过10氨基酸残基的肽叫多肽。因为多个氨基酸以肽键连接的是一条链，也叫多肽链

(Note:不同教材上具体的氨基酸残基数量有所不同)73743肽的组成:氨基酸残基,肽键.◆多肽链的骨架由重复的肽单位排列而成，称为主链。即由肽键将多外氨基酸残基连接成一条长链。

◆N-末端:有游离的α-NH2,写于肽链的左端,用“H”表示

◆C-末端:有游离的α-COOH,写于肽链的右端,用“OH”表示.

◆N-未端H2N-CH(R1)-CO-NH-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-COOHC-未端命名:*氨酰*氨酰*氨酰*氨酸(H→OH)

75二肽的重要性质1肽的酸碱性质◆肽与氨基酸一样,在晶体、溶液中都以两性离子存在.◆在pH0-14范围内,肽键内的亚氨基不能解离,因此其酸碱性质主要由N-未端的α-氨基和C-未端的α-COOH,以及侧链R基团上的可解离的功能基团.76◆肽链末端的α-NH2与α-COOH的间隔比游离氨基酸中的大，它们间的静电引力较弱。

肽中的C-未端的α-COOH的pK′比游离氨基酸中的大,

N-未端的α-NH2的pK′比游离氨基酸中的小。

R基的PK′在两者间的区别不大。772肽的化学性质◆肽的N-未端游离的的α-氨基也能发生Sanger反应和Edman反应,N-末端的氨基酸残基也能发生茚三酮反应.C-未端游离的α-COOH也能发生与氨基酸相似的反应.

◆肽与蛋白质特有双缩脲反应.78三天然存在的活性肽1谷胱甘肽(GSH):Glu,Cys,Gly◆三肽,Glu的γ-COOH与Cys的α-氨基形成的γ-肽键,一个游离的-SH.◆谷胱甘肽是一些氧化还原酶的辅因子.◆谷胱甘肽中的SH暴露在分子外面的,较活跃的基团.这个SH基又可与另一个谷胱甘肽结合起来成为氧化型的谷胱甘肽。2GSH→GSSG79γ–谷氨酰半胱氨酰甘氨酸80

解毒作用：与毒物或药物结合，消除毒性作用；

参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；

保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；

维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。812脑啡肽:脑中比吗啡具有更强镇痛的五肽Met-脑啡肽H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OHLeu-脑啡肽H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH3短杆菌肽S:5种氨基酸组成的环10肽,有D-aa,它抗革兰氏阳性细菌,含有鸟氨酸(Orn)4加压素(ADH):Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2(两个Cys间有双硫键)8283第四节蛋白质的分子结构二蛋白质构象三蛋白质的二级结构四超二级结构和结构域六蛋白质四级结构五蛋白质三级结构一蛋白质的一级结构84一蛋白质一级结构1一级结构：◆蛋白质肽链中的氨基酸的排列顺序,包括二硫键的位置。一级结构是最基本的结构，高级结构主要是由一级结构决定的.◆一级结构专指氨基酸的序列。蛋白质的化学结构则包括肽链数目、两端氮基酸组成、氨基酸序列、二硫键的位置，也称共价结构。

85◆确定一级结构的生物学意义：

推测蛋白质高级结构及其功能、作用机理；

比较不同生物来源的相似蛋白质的氨基酸序列，可以洞悉其功能和进化关系；

蛋白质氨基酸突变86◆例：胰岛素由51个氨基酸残基组成，

A链:21个氨基酸残基，B链:30个氨基酸残基

A、B链间由两个二硫键连接起来，

A链第7位-B链第7位的二个Cys，

A19-B20两个Cys的SH基形成的。

A链内的第6位与第11位的Cys形成链内二硫键。

胰岛素分子的一级结构有二个链间二硫键和一个链内二硫键，共有三个二硫键。87A链(21aa)HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys6-Cys7-Ala-Ser-Val-Cys11-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys20-AsnOHB链(30aa)HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys7-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys19

-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala30OHS—SSSSS61177201988

TheNobelPrizeinChemistry1958"forhisworkonthestructureofproteins,especiallythatofinsulin"FrederickSangerUnitedKingdomUniversityofCambridge

Cambridge,UnitedKingdomb.1918892蛋白质一级结构的测定策略：(自学)◆将待测蛋白质纯化.◆测定多肽链的数目。蛋白质N-或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的摩尔数来确定。◆拆分蛋白质分子的多肽链(变性剂如尿素和盐酸胍)

◆拆开所有的二硫键(过甲酸氧化-S-S-为-SO3,β-巯基乙醇可将-S-S还原为-SH,◆测定多肽的氨基未端和羧基未端。90

N-end:▽Sanger法(DNFB):DNP-多肽→水解得游离aa+黄色DNP-aa(N-端)▽DNS法:具荧光DNS-aa(N-端)▽苯异硫氰酸酯(PITC)法：▽氨肽酶法:N端外切酶,得游离的氨基端aa91

C-end:▽肼解法:蛋白质或肽与肼加热发生肼解,反应中除C-端aa以游离形式存在外,其它aa均都转变为相应的氨基酸酰肼化物,它们可以与苯甲醛作用而沉淀,上清液中的C-端a可以借DNFB法等方法鉴定.

▽羧肽酶法:它专一地从肽链的C-端开始逐个水解,释放出游离A.根据释放出的aa量(摩尔数)与反应时间的关系,便可知肽链的C-未端a的顺序.羧肽酶A:能释放除Pro,Arg,Lys外的所有C-端残基.羧肽酶B:只能水解以碱性aaArg和Lys为C-末端残基的肽键.92◆多肽链断裂成多个肽段.用几种不同的方法将同一肽链降解成几套肽段,并将它们分开。◆测定各个肽段的aa组成与顺序.Edman法(蛋白质顺序仪)◆确定肽段在多肽链中位置:交错重叠法拼凑出完整多肽链的氨基酸序列。◆确定原多肽中-S-S-的位置。933肽链内切酶的作用位点(自学)

↓

N-端A-B—C-D-C-端◆胰蛋白酶(trypsin):B为Lys或Arg(提供羧基),Pro提供的-NH的肽键不能被水解,即C为Pro时水解被抑制.◆胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶，chymotrypsin):B=Phe,Trp,Tyr等疏水性aa提供的COOH所形成的肽键,B为Leu,Met,His水解较慢,C不能为Pro。◆胃蛋白酶(pepsin):水解由疏水氨基酸形成的肽键,B,C=Phe、Tyr、Trp、Leu.B不能为Pro94◆木瓜蛋白酶:B为Lys,Leu,Arg,Gly◆梭状芽孢杆菌蛋白酶(Arg酶):B为Arg◆溴化氰(CNBr):B=Met,将它转化为高丝氨酸◆NH2OH(羟胺):专一性水解Asn—Gly,Asn-Leu、Asn-Ala也能部分水解◆嗜热菌蛋白酶:C=Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,Met等疏水性强的aa,C为Gly,Pro时不水解.◆葡萄球菌蛋白酶(Glu酶)：B为Glu或Asp(提供COOH。95凝血酶：thrombinV-8蛋白酶枯草杆菌蛋白酶：subtilisin脯氨酰内切酶:prolylendopeptidase嗜热菌蛋白酶:thermolysin96974例:某一肽段的aa组成为:Met,Tyr,Ser,Phe,Gly,Lys,Ala.◆用Sanger试剂处理得α,ε-diDNP-Lys◆CNBr裂解得二肽:之一含有Lys+Met(已变成高丝氨酸),之二含有剩余aa.◆羧肽酶处理时很快得Gly.◆胰凝乳蛋白酶处理时得三个肽段:之一含Tyr,Lys,Met,其二含Ala,Gly,其三含Ser,Phe.该肽段的aa组成顺序为:Lys-Met-Tyr-Ser-Phe-Ala-Gly.98二蛋白质的构象1构型:◆立体异构体中不对称碳原子上的各原子、或取代原子或基团的空间取向.如几何异构体和光学异构体。◆一个C原子和四个不同的基团相连时,只可能有两种不同的空间排列,这两种不同的空间排列称为不同的构型:D-构型，L-构型.◆构型的改变伴随着共价键的断裂和重组.992构象:◆与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布,可能形成的不同的立体结构.◆空间位置的改变并不涉及共价链的断裂。1003蛋白质的构象◆各种键长：Cα－C:0.153nmC=O:0.124nmCα－N(NH2):0.146nm

C-N(肽键):0.132nm(在有机胺0.149nm)C=N:0.127nm故肽键C-N键介于Cα-氨基、C=N两者间,有部分双键性质,不能自由旋转,绝大多数形成刚性的酰胺平面(或肽平面).1010.132nm102Cα

O||CN|HCαC||OH|NCα

0.132nmΦ[fai]Ψ[psai]

R|103肽键.132nm.146nm.124nm.153nm◆Cα-N,C-Cα单键可以自由旋转,这样两个相邻的酰胺平面能以共同的Cα为定点面旋转,绕Cα-N旋转的角度为Φ,绕C-Cα键旋转的角度为Ψ.Φ,Ψ称为构象角(–180°—180°）。104◆主链上有1/3是有双键性质的C-N,不能旋转.但天然蛋白质的构象却很少。

原因：主链上有很多R侧链,其大小及电荷情况各异,在单链旋转时它们产生空间位阻和静电效应,制约着大量构象形成,

因此实际上一个天然蛋白质多肽在一定条件下只有一种或很少几种构象,而且相当稳定。1054稳定蛋白质构象的作用力◆非共价键(次级键):键能低、稳定性差,但数量大

氢键,

范德华力

疏水力:疏水基团的相互作用,实际上是疏水基团或疏水侧链避开水分子而相互靠近聚集的作用.

离子键(盐键)◆共价键:二硫键、酯键、配位键106三蛋白质的二级结构◆蛋白质二级结构:多肽链主链的不同肽段彼此靠近的氨基酸残基之间由于氢键的相互作用而形成的空间关系，即蛋白质多肽链本身通过氢键盘绕、折叠而形成的构象。◆天然蛋白质一般都含有α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲等二级结构。1071α-螺旋◆肽链中的酰胺平面绕Cα相继旋转(Φ=-57°、Ψ=-48°),即形成α-螺旋.

多肽链几乎都是右手螺旋(比左手螺旋稳定)。

◆3.6个aa/每圈，每圈间距0.56nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，螺旋上升时，每个氨基酸残基沿轴旋转100°◆螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧,链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴。108◆每个氨基酸残基的N-H与前面第四个氨基酸残基的C=O形成H键,肽链上所有的肽键都参与了氢键的形成,因此α-螺旋相当稳定.

若遇到Pro,螺旋就中断。？？因为Pro是α-亚氨基酸，其残基没有多余的氢原子形成氢键。

螺旋的形成表现出协同性。10912345110◆影响α-Helix形成及其稳定性的因素

氨基酸组成:▽Pro:Cα参与R基吡咯环的形成,环内的Cα-N键和C-N都不能旋转,且多聚Pro的肽键不具亚氨基,因此不能形成链内氢键.因此在Pro或Hypro处,α-Helix被中断.▽Gly:不具旋光性,左手构象和右手构象完全等同。实际上有一半的Gly的Φ为正值,即可形成左手螺旋,如左手螺旋只在少数蛋白质中发现。嗜热菌蛋白酶中有一很短的左手α-螺旋,由Asp-Asn-Gly-Gly组成.111

R基团的电荷性质▽同性电荷的排斥

Poly(Lys)在pH7时R基团带正电荷,彼此间由于静电斥力,不能形成链内氢键,pH12时,R基团不带电荷,则可以自动形成α-Helix.

Poly(Glu)带负电荷,相似.

不带电荷的Poly(Ala)在pH7时则可自发形成α-Helix

R基团的大小太大的R基团可能形成空间阻碍,因而不能形成α-Helix.如:Poly(Ile),1122蛋白质的β-折叠结构:◆伸展的多肽链(两条或多条，或一条肽链的若干肽段)靠氢键联结而成的锯齿状片结构.◆β-折叠结构与α-螺旋结构相比有如下特点：

α-螺旋结构的肽链是卷曲的棒状结构，而β-折叠结构的肽链几乎是完全伸展的、整个肽链成一种折叠的形式。

β-折叠结构可以是肽链与肽链之间形成氢键，α-螺旋是链内形成氢键.113

β-折叠有两种类型：▽平行式:即肽链的所有N端都在同一端。▽反平行式:即相邻两条肽链的方向相反，一条为N端，另一条为C端,较稳定。1141151163β-转角:也叫做β-回折(β-turn),◆肽链回折180°,使得氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基(n+3)的-NH形成氢键.

在转角处肽键的取向决定了有两种主要类型(Ⅰ和Ⅱ)。Ⅱ型转角的第三个氨基酸残基经常是Gly.◆Gly和Pro经常出现在β-转角。Gly的R基团为H，很小，空间位阻小。Pro：R基团的环状结构117COHNN-endH-end1234118119-转角：一个氨基酸(脯氨酸)在氢键链外。1204无规则卷曲(自由回转):

◆在球状蛋白质分子中,除α-螺旋、β-折叠、β-转角外,还存在着一些没有确定规律的盘曲，没有一定规律的松散肽链结构。这种构象称为无规则卷曲。

◆有利于蛋白质功能的实现，有利于形成灵活的,具有特异生物活性的构象.121◆氨基酸顺序与二级结构形成间的某些关系:

Glu,Met,Ala：形成α-螺旋的能力最强,

Val,Ile：最可能形成β-折叠;

Pro,Gly,Asn,Ser：在β-转角中最常见.

Gly-Pro-Ser:很可能形成β-转角.

Ala-His-Ala-Glu-Ala：很可能形成α-螺旋。◆许多的新生肽在细胞内的正确折叠需要有辅助折叠的蛋白质—分子伴侣(Chaperon)的存在.

作用:防止不合适的相互作用.它与新生蛋白结合,保护了一些高度疏水或高度亲水表面,以防止蛋白质的凝集.Insummary(课后阅读相关文献)122123124125四蛋白质的超二级结构和结构域1超二级结构:◆蛋白质中相邻的二级结构单位(α-螺旋，β-折叠，β-转角)组合在一起,形成有规则的在空间上能辩认的二级结构组合体.◆基本形式为:αα,β×β,βββ作为超二级组合单元.126

αα:二或三股右手α-helix彼此缠绕形成左手超螺旋(α-角蛋白质,肌球蛋白等).

β×β:两段平行的的β-链(单股β-折叠)和一段连接链(α-helix或无规卷曲)组成.常见的是:βαβαβ(乳酸脱氢酶,丙酮酸脱氢酶)127128

βββ:三条或更多条反平行式β-转角或其它肽链连接而成,也叫β-曲折。长的β-链形成的βββ单元可全部或部分地卷成一个桶状,称β-折叠桶(Cu、Zn-SOD,免疫球蛋白质)1291302结构域:◆在二级结构或超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的组装体。

是球状蛋白质的独立折叠单位，是三级结构的局部折叠区。一个蛋白质可能有一个或多个结构域。如木瓜蛋白酶有两个结构域：一个为α-螺旋结构,一个为β-折叠桶。

有时也称功能域，是蛋白质分子中能独立存在的功能单位。每个功能域可有一个或多个结构域。131◆多结构域的酶：结构域间有酶的活性中心。结构域间的连接常常只有一段肽断相连，使结构域容易发生相对运动。这种柔性有利于活性中心结合底物和施加应力,也有利于别构中心结合别构物和发生别构效应。132133五蛋白质的三级结构(tertiarystructure)1三级结构：多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成特定的、有一定空间构象的球状分子结构，是在一定条件下热力学上最稳定的空间构象。

1341352蛋白质三级结构的共同特征：◆具三级结构的蛋白质有多种二级结构单元。◆球状蛋白质三维结构具有明显的折叠层次。◆三级结构的蛋白质分子为球状或椭球状，疏水侧链往往埋藏在分子内部，亲水侧链在分子表面，分子表面主要是亲水氨基酸，球状蛋白也是溶于水的。◆球状蛋白质分子表面往往有一空穴，分布着疏水侧链，是结合底物、效应物并行使功能的活性部位。1363维持三级结构的因素非共价键(次级键)、共价键◆氢键:◆范德华力：这种作用力很弱,但可以累加。◆疏水作用:由疏水基团之间的相互作用形成的疏水力。主要介质水分子对疏水基因的排斥所形成。◆离子键(盐键)它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。137◆二硫键：两个Cys残基的-SH经氧化作用而形成。◆酯键:氨基酸残基的-OH与另-氨基酸的COOH脱水形成酯键。◆配位键:两个原子之间由单方面提供共用电子对形成的共价键称为配位键,蛋白质中含有的金属离子以配位键相连。138139六蛋白质的四级结构1四级结构：由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合在一起，从而形成有特定三维结构的蛋白质构象。2亚基：蛋白质的四级结构每一肽链称为亚基。四级结构是由具有一、二、三级结构的几个亚基构成。单独的亚基并无活性,只有聚合成四级结构才具有生物活性。由多个亚基构成的蛋白质：寡聚蛋白质

1403分类：◆不均一四级结构:不同亚基构成.例如血红蛋白(hemoglobin)：红细胞的主要成分,运输O2和CO2。α2β2:两个α-亚基和两个β亚基组的四聚体.单独的α-链或β链则没有运输O2或CO2的作用。

原体：一般说是亚基，但原体可以是二个或多个亚基的聚合体。如一个α、一个β亚基构成了一个原体。◆均一的四级结构:由相同亚基构成.如细菌叶绿素a蛋白(3个相同亚基)。1414四级结构的特征：◆对称性：多数寡聚蛋白质分子的亚基的排列是对称的,对称性是四级结构蛋白质分子的重要性质之一。◆结构与功能上的优越性：增强结构的稳定性；使催化基团汇集在一起，提高遗传经济性和效率；具有协同性和别构效应。

别构效应：蛋白质与配基结合后改变构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。5维系蛋白质四级结构的作用力亚基间的化学键主要是二硫键和疏水力,其次氢链,范德华引力。142143144第五节蛋白质分子结构与功能的关系一一级结构与功能的关系1同功能蛋白质的种属特异性2一级结构变异与分子病3蛋白质前体激活与一级结构二蛋白质构象与功能的关系1变性与功能2构象转化与功能145一蛋白质一级结构与功能的关系1同功能蛋白质种属特异性与一级结构的关系

◆细胞色素C(cytC)：脊椎动物：104个氨基酸，昆虫：108，植物：112◆亲缘关系越近其结构越相似。◆约28个氨基酸是各种生物共有的，为不变氨基酸，为其功能所必须的，◆第14、17位上的cys是与血红素辅基相连位点，◆第70-80位成串的不变氨基酸可能是酶结合部位。◆保持氨基酸残基不变的区域：保守部位，在进化上与功能紧密相关。也可能包括：氨基酸残基发生变化，但它们的疏水性没有变化1461472蛋白质的一级结构变异与分子病

分子病是指某种蛋白质分子一级结构的aa排列顺序与正常蛋白质有所不同的遗传病.

血红蛋白,574氨基酸。Hb-A(正常)β-链6位为Glu，Hb-S(病人)β-链6位为Val.

Glu的侧链为带负电荷的亲水羧基,Val侧链不带电荷.Val取代Glu后,使Hb表面的荷电性和PI改变,溶解度下降,不正常聚集成长纤维状血红蛋白,使红细胞变成镰刀状,输氧能力下降出现镰刀型贫血。1481493蛋白质前体的激活与一级结构

很多功能蛋白质以无活性的前体肽的形式产生和贮存。在特定条件下经水解去掉一部分肽段后形成特定构象才变成有活性的蛋白质。

◆胰岛素

合成时有84氨基酸，一条链。

激活过程:水解成一个C肽(29氨基酸),A-链(21氨基酸)和B-链(30氨基酸),第31(Arg)、32(Arg)、62(Lys)、63(Arg)处四个氨基酸被除去.

A与B链通过两个链间S-S-键和一个链内二硫键构成一级结构,后形成特定构象具有其完整的生物活性.150151二蛋白质高级结构与功能的关系1变性与功能

如尿素,β-巯基乙醇等使蛋白质构象破坏而变性,成无规则线状肽链,导致功能丧失：变性如及时除去变性剂,酶则可恢复原来的构象,恢复其功能：复性

核糖核酸酶的变性与复性1521532蛋白质构象转化与功能血红蛋白：HbA:α2β2,含量占96%以上；HbA2:α2δ2,2%左右；胎儿：HbF:α2γ2HbA:α2β2

未与氧结合时,其构象为T态(紧密态)，与氧结合能力很弱(亚基间有8个盐桥)。Hb与O2结合后,Hb的构象处于R态(松驰态),有利于与O2的结合.

154一旦氧与一个亚基的血红素铁结合后,引起该亚基构象发生某些特定改变,同时引起协同效应,其它亚基的构象改变,使整个分子的构象变成R态(松弛态),使所有血红素铁适宜与O2结合,提高结合氧的速度.Hb的运O2功能通过R态和T态构象的互变实现155156第六节蛋白质的重要性质与分离纯化一重要性质2胶体性质3蛋白质的沉淀4变性与复性5蛋白质的紫外吸收6蛋白质的呈色反应二蛋白质的分离纯化(自学)三蛋白质分子量的测定(自学)1两性性质157一重要性质1两性性质及等电点

◆末端α-氨基和α-羧基、β-羧基（Asp)、γ-羧基(Glu)、ε-氨基(Lys)，咪唑基(His)胍基(Arg)、酚基(Tyr)和疏基(Cys)等，在一定的pH条件下，使蛋白质呈酸性或碱性.158◆在碱性溶液中蛋白质如酸一样释放H+而带负电荷，在酸性溶液中则如碱一样接受H+而带正电荷。当溶液在某一pH值时，特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）159◆蛋白质pI:与蛋白质所含aa的种类,数目有关,即酸性、碱性氨基酸的比例.

中性蛋白质(酸性、碱性氨基酸的数目接近):pI为中性偏酸(-COOH的解离度略大于-NH3+).

酸性蛋白质的pI偏酸,碱性蛋白质的pI偏碱.160◆电泳:

带电粒子（蛋白质）在电场中向与其自身带电相反的电极移动的现象。

泳动方向和速度:带电性质、分子大小、形状

可用电泳分离、纯化、鉴定和制备蛋白质、测定蛋白质的分子量。161◆等电点与沉淀和溶解度的关系：

在蛋白质的pI时,蛋白质的的溶解度最小(因此时以两性离子存在,净电荷为0,没有静电斥力,分子极易聚集而沉淀)，因而可用来分离纯化蛋白质。

在非等电点状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。1622蛋白质的胶体性质(分子颗粒直径Φ<1nm为溶液,>100nm时为悬浊液)◆水溶液中蛋白质的单分子为1-100nm,故具胶体的性质(如丁道尔效应,布朗运动,具有吸附能力,不能透过半透膜等)◆蛋白质是稳定的亲水胶体原因：？163

蛋白质的表面有很多亲水基团。

在非等电点时,蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥.如-COOH、-NH2、-OH、-SH、-CONH、咪唑基、胍基等.它们极易吸附水分子,在蛋白质表面形成一层水膜、双电层,隔开蛋白质颗粒,使颗粒不致因碰撞凝聚而沉淀.164◆除去水膜、蛋白质所带电荷被中和,亲水体系破坏而沉淀→盐析法和分段盐析法的依据。◆蛋白质颗粒不能透过半透膜→透析法(将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋中，然后置于流通水中进行透析)来分离纯化蛋白质。1653蛋白质的沉淀◆蛋白质溶液的稳定性是有条件的,相对的。与质点大小,电荷,水化作用等有关。破坏蛋白质分子外的水膜，或中和蛋白质分子所带的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定,会出现沉淀.◆蛋白质沉淀：蛋白质因某些物理化学因素自溶液中析出的现象。◆影响蛋白质所带电荷和水化作用的因素(使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层)都会使蛋白质沉淀。166

利用中性盐(NH4)2SO4,MgSO4,NaCl等)

▽盐析：加入高浓度的中性盐而使溶液中的蛋白质沉淀析出的现象叫盐析.盐析的原因：中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层,中和了电荷.

▽盐溶：盐析初期，溶液离子浓度低，随着中性盐浓度提高,蛋白质分子吸附盐离子后带电表层使它们彼此排斥,与水分子之间的相互作用却加强了，因而溶解度提高，这种现象称为盐溶（Salting-in）。◆沉淀蛋白质的方法：167168169

▽分段盐析：各种蛋白质的亲水性及带电性质均有差别，因此沉淀所需中性盐浓度也不同，调节中性盐浓度就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法叫做分段盐析.

有机溶剂沉淀法:当加入有机溶剂如丙酮、乙醚、乙醇等,蛋白质即发生沉淀。可能与降低蛋白质溶液的介电常数有关,与水膜的破坏有关170171

金属盐类沉淀:pH>pI时,蛋白质带负电荷，易与带正电荷的重金属结合而沉淀，如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+.误服重金属盐的病人可口服大量牛奶,豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐。

生物碱试剂沉淀法:

生物碱类（Alkaloids）是存在于生物体（主要为植物）中的一类含氮的碱性有机化合物，大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性

生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂,如单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸，这些都有-COOH.在酸性条件下(pH<pI),蛋白质带正电荷可以与带负离子的酸根结合发生沉淀。172

加热变性沉淀:▽几乎所有蛋白质都能因加热变性而凝固。▽少量盐能促进蛋白质的热变性。▽处于pI时,蛋白质的加性凝固最完全和最迅速。如大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤(MgCl2),制取豆腐。1734蛋白质的变性与复性◆蛋白质变性(De-naturation)：

物理因素(如热、高压、紫外线照射)或化学因素(如有机溶剂：脲、酸、碱等)能使蛋白质分子构象发生变化,致使蛋白质的理化性质和生物活性发生变化,但一级结构未被破坏(即肽链的共价键和二硫键没有断裂）。

变性作用的实质：

蛋白质分子的空间结构的改变或破坏，从有秩序而紧密的构造，变为无秩序松散的构造，易被蛋白水解酶水解（熟食易消化）。174

蛋白质变性的表征:▽生物活性丧失▽溶液度降低，粘度增加，易絮凝。▽埋藏在分子内部的侧链基团(Trp,Tyr等)暴露到分子表面,从而出现光谱变化。▽生化性质的改变,变性蛋白质的结构松散,易被水解酶作用。175176◆复性：如果引起变性的因素比较温和，蛋白质构象仅仅是有些松散时，当除去变性因素后，蛋白质可缓慢地重新自发折叠恢复原来的构象叫复性。◆变性和沉淀的区别:一般来说，变性是指蛋白质的空间结构破坏，生物活性丧失，变性了的蛋白质是一定要沉淀下来的。但是沉淀了蛋白质不一定就变性了,如很多酶制品已制成结晶，仍保持生物活性因为结构并没有改变。1775蛋白质的紫外吸收◆蛋白质中的Tyr、Trp、Phe残基在近紫外线区有光吸收，使蛋白质在280nm处有最大特征吸收。

由于不同的蛋白质中此三种氨基酸含量不同，因此所测结果有差异。核酸在260nm处也有特征光吸收，对蛋白质测定产生一定的影响。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260

(范围0.1-0.5mg/ml)1781796蛋白质的呈色反应

◆双缩脲反应

双缩脲是两分子脲加热放出一分子NH3而得的产物。它在碱性溶液中能与CuSO4反应产生紫红色到蓝紫色络合物.蛋白质中含有许多与双缩脲相似的肽键。用于蛋白质和肽的定性定量。180

NH2

/C=O

\

NH2

NH2

/C=O

\

NH2

加热

NH2

/C=O

\

NH/C=O\NH2+NH3

181◆酚(福林)试剂反应:

蛋白质的Tyr酚基能将福林试剂中的磷钼酸和磷钨酸还原成蓝色化合物(钼蓝和钨蓝的混合物),这一反应常用来测定微量蛋白质。◆茚三酮反应与氨