转化细胞方法及原理

实验目的了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。实验原理转化(Transformation)是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化中的受体细胞：转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM符号表示。转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源DNA分子的受体细胞(Transformant)。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。O如0。含Amp培养基影响转化率的因素细胞生长状态和密度。转化的质粒DNA的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源DNA的污染。实验试剂大肠杆菌DH5a，LB培养基，，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷），氨苄青霉素，pUC18质粒实验步骤菌株活化：用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5a，在LB培养基平板表面划线，于37°C培养16小时挑取一个单菌落，转到3—5mlLB培养基中，于37C培养3—5小时将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2—3小时，到OD600=0.3—0.4感受态细胞制备：将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15—30min5.4000rpm离心5min,弃上清6.加入0.8ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7.4000rpm离心5min,弃上清加入0.2ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15%的甘油可一70C长期保存外源DNA的转化：取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min于42C水浴90S冰上放置2min加入800plLB液体培养基于37培养1小时将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上将平板放置于37C恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积/涂板菌液体积转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数=对照组2菌落数X稀释倍数X菌液总体积/涂板菌液体积感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数(二)重组DNA的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600或DH5a，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷(rk-mk-rec-)同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感(Ap)。在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素(Ap)基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的8一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我们可以利用外源基因插入载体8一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去8一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。因pUC18带有Ampr基因而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pUC18DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pUC18上带有8-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和8-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。E.coliDH5a菌株带有8-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pUC18和DH5a编码的8-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pUC18和DH5a融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的8-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫a-互补。由a-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-漠-4氯-3-吲哚-8-D-半乳糖苷）存在下被IPTG（异丙基硫代书-D-半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段TGFpI插入到pUC18质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去a-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为a-互补现象筛选。本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。DNA分子转化的原理较复杂：1、吸附一一完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面。2、转入一一双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解。3、自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。4、表达一一供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。对DNA分子来说，能被转化进受体细胞的比率极低，通常只占DNA分子的0.01%，改变条件，提高转化率是很有可能的，一些研究表明下列因素可以提高转化率：（1）受体菌细胞与DNA分子两者比例在1.6X108细胞：1毫微克DNA分子（4.3Kb）左右转化率较好；（2）DNA分子与细胞混合时间为1小时最佳；（3）铺平板条件会影响转化率；（4）对不同转化菌株热处理（效应不一致）。除上述因素外，转化试验还注意如下问题：1、连接DNA反应液与受体细胞混合时，一定保持在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率将极差。2、热处理2分钟后，要迅速加进1毫升LB以使表型表达，延迟加LB，将使转化率迅速降低。3、在平板上涂布细菌时。注容避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械压涂布将会使细胞破裂。影响转化率。（二）菌种大肠杆菌C600或DH5a（rkrecmk）（三）培养基与试剂LB液体培养基（1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaClpH7.5。）100mmol/LCaCl2氨苄青霉素溶液（50毫克/毫升）DNA连接反应液X-gal储液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，储存于-20°C。6.IPTG储液(200mg/ml):在800pl蒸馏水中溶解200mgIPTG后，用蒸馏水定容至1ml,用0.22pm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20C。含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60C左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50pg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal储液和4plIPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37C下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收，备用。二)重组DNA转化取0.2ml大肠杆菌感受态细胞，在无菌条件下，加入到连接液的Eppendorf管，混匀，置冰浴中30分钟。冰浴后，将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42C的的恒温水浴槽内，保温2分种。热冲击处理后的细胞易死亡，应迅速倒入LB培养液1毫升，(无抗菌素LB液，有助于基因表达)马上置37C水浴1小时，每10分钟翻转1次。用移液器取0.1毫升的转化菌液直接涂布含50pg/mlAmp、40mlX-gal储液和4plIPTG储液LB固体平皿上，共涂布三个培养皿。用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1毫升直接涂布于含50pg/mlAmp、40mlX-gal储液和4plIPTG储液LB固体平皿上，作为受体菌对照。将第14、15步涂布培养皿先放室温15分钟左右，使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中37C培养过夜。第二天