(16)-24常用分子生物学技术原理及应用

第二十四章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication分子杂交与印迹技术

MolecularHybridization&BlottingTechnology第一节DNA变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。

Tm：(meltingtemperature)

变性是在一个相当窄的温度范围内完成,在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度。其大小与G+C含量成正比。

DNA的复性

复性(renaturation):在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。退火(annealing):

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性复性条件：Tm－50C

热变性的DNA迅速冷却至4度以下几乎不能发生复性（一）核酸分子杂交

(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双(heteroduplex)

。一、分子杂交与印迹技术的原理DNA-DNA杂交双链分子变性

复性不同来源的DNA分子核酸分子杂交(hybridization)

复性RNADNA1.原理变性与复性2.常见条件：加热

S形曲线解链温度（Tm）

A260增高的原因3.分子杂交的目的

核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置鉴定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础（二）探针技术

探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

探针标记方法:放射性：32P、35S和3H

非放射性：生物素、地高辛素、荧光素

(FITC、罗丹明)二、印迹技术（印迹杂交）

将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹）或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。应用于DNA、RNA、蛋白质检测电转移印迹技术、真空吸引转移印迹※印迹技术的分类及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。

其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)

DNA芯片技术(DNAchip)（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性、定量及相互作用的研究。

（一）DNA印迹技术

(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。从组织或细胞中提取基因组DNA→限制性内切酶消化→琼脂糖凝胶电泳将DNA按大小分离→含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性→DNA变性后从凝胶转移到固相支持物上→特异性探针与固着于膜上的DNA杂交→杂交结果反映待测核酸样品的有关基因信息。Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜（二）RNA印迹技术

(Northernblotting)

基本过程与Southernblotting相似。用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。常用抗体来检测蛋白质，也被称为免疫印迹技术。靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。实验操作

1细胞裂解物的准备；

2细胞裂解物的蛋白定量；

3细胞裂解物的SDS；

4蛋白质的转移；

6目的蛋白质的检测。蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量测定相对含量时，需要内参照选择合适的反应条件：SDS胶浓度；转移膜的选择；转移时间的选择注意电极的正负极抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡操作要轻柔。蛋白质免疫印迹法三种印迹技术的比较放射自显影照片DNA点阵聚合酶链反应

PolymeraseChainReaction

第二节回顾体内DNA复制的条件？模板引物原料：dNTPDNA聚合酶PCR概述概念：在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

PCR类似于DNA在细胞内的复制过程，可以将微量目的基因扩增一百万倍以上。PolymeraseChainReaction

（PCR）微量目的DNA片段扩增到100万倍以上。

1985年，美国PECetus公司的KaryMullis（凯利.穆利斯）建立了PCR技术，使人们能够通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍，KaryMullis因此获1993年度诺贝尔化学奖。

聚合酶链反应

(PolymeraseChainReaction，PCR)

PCR的发展1983.04萌发PCR构思1983.08首次做有关PCR原理报告1984.11获得与预期DNA相符的扩增量1985.03.28申请了有关PCR的第一个专利1987.06有关PCR的主要专利被批准1988第一个试剂盒和自动PCR仪相继上市意义：20世纪最伟大的发明之一，具有划时代意义，DNA合成摆脱了活体生物的依赖性，成为常规技术。

PCR的显著特征应用领域极其广泛

实验研究：克隆基因、DNA序列分析、获得定点突变的DNA片段、测定染色体上两个位点之间的重复值以绘制基因图等。

临床应用：病毒性病原体的检测、遗传性疾病的产前诊断等。基本组分耐热DNA聚合酶Buffer-Mg2+dNTPs模板特异性引物※一、PCR反应体系TaqDNA聚合酶：

水生栖热菌(thermusaquaticus,Taq)

的DNA聚合酶

作用：

①5′3′

DNA聚合酶活性；②无3′5′外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别

耐热DNA聚合酶最适温度：

72℃，选择72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5～6min

延伸温度（72℃）≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性pfuDNA聚合酶作用：5′3′DNA聚合酶活性

3′→5′外切酶活性优点：耐热、精确度pfu>Taq不足：但pfu扩增效率通常比Taq酶略差文献报道：Taq+pfu

会起到较好效果

现阶段的耐热DNA聚合酶Taq酶快速扩增Taq热启动Taq高保真DNA聚合酶Real-TimeTaq超长链Taq引物特点引物(primer)与模板特异结合。5′3′3′5′（2）引物(primer)长度在15-30bpATCG5′－TAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGAAGGCCATAATCACTTTCTTAGCGAATGGGGGGAGCTCTGTAGTAAGCAGGAACAGTTGCAGGGAAGAACAATAGGGAAAATAATTCCAGATGCACCCAAAATCAATCT－3′引物特点XXXXXX(1/4)1(1/4)2(1/4)3nX…………….………(1/4)n引物长度大于15时，引物出现的几率小于(1/4)15

可以保证模板与引物结合的特异性难点引物本身不要出现内部互补序列，形成loop环，内部二级结构。如：5

′GGGTCGATTCCTACCCATGC3′(3)避免引物(primer)内部互补序列CCTACCCATGCAGCTGGG5′3′引物特点

避免两引物间的互补，特别是3'端互补，以免形成二聚体。(4)避免两引物(primer)间互补如：5′TACCCATGCATGGAGTC3′

3′GGGTCTATCAGTAAGC5′引物特点引物浓度一般0.1～1µmol/L

浓度过高会使引物聚合或使非特异扩增。(5)引物(primer)浓度：可在引物的5′端引入限制性酶切位点、ATG起始位点等。(6)可在5′端修饰引物特点http//www.BCMSearchL软件

Primerpremier5.0软件

dnadmo25可以设计引物的网页和网站http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/进展特异性引物进展引物特点小结引物与模板要特异结合；(2)引物长度在15-30bp；(3)避免引物内部互补序列；(4)避免两引物间互补；(5)引物浓度：µmol/L；(6)可在5′端修饰。

引物设计有五点，个数二十为最好；5′不严3′严，umol/L要记牢；引物之间无交叉，自身互补不能要；网上查询特异性，PCR一定能做好！巧记口诀引物特点模板1.RNA2.DNAmRNA→逆转录→cDNA质粒噬菌体染色体DNA模板的组成模板1.变性难度2.模板用量克隆DNA:ng级染色质DNA:ug级克隆DNA

<染色体DNA注意事项防止交叉污染dNTP底物四种脱氧核苷酸：基本原料终浓度：50umol/L注意：不稳定，保存时间长会失效缓冲液1、组成：Tris-HCl、KCl、MgCl2、明胶、甲酰胺。２、关键为Mg2+

：影响酶活性与精确度以及产物的特异性。出现非特异性条带，改变镁离子浓度Mg2+

TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+外界影响：

EDTA鳌合Mg2+∴选较低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+

结合，降低Mg2+有效浓度。∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的Mg2+浓度

（1）变性温度：94-95℃

GC比例高、长度很长，T↑

（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm↑退火T↑；Tm↓退火T↓若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：

500nt1min500nt－－3min一般：40－60sec6.温度二、PCR技术的工作原理变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C※

二、PCR技术的工作原理1、变性：将反应体系加热至95℃

，使模板DNA完全变性成为单链；2、退火：将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5℃），使引物与模板DNA结合；3、延伸：将温度升至72℃

，DNA聚合酶以

dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25~30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。模板DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55基本工作原理Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCRCycle反应步骤变性（Denaturation）

:

双链DNA在95oC解链。退火（Annealing）

:引物与DNA相结合。65-40oC延伸（Extension）

:新双链DNA在72oC合成。循环1次2个循环2次4个循环3次8个基因扩增过程理论上原始1个=20循环1次2个=21循环2次4个=22循环3次8个=23……………循环N次2n实际上：25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。y=2xPCR的特点灵敏度高

扩增量达230个拷贝（109拷贝）简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA特异性强小结1.PCR反应基本原理变性退火延伸

95oC65-40oC72oC2.PCR体系基本组成成分模板、引物、dNTP、缓冲液Mg2+、耐热DNA聚合酶3.PCR循环次数25～30次（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析三、PCR技术的主要用途四、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术

利用实时荧光定量PCR的原理，对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。它是在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它已逐渐代替了Northerblot以及semiRT-PCR技术。Real-timePCR实时PCR技术原理第三节

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)DNA测序的基本战略

设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。

酶法化学法测序技术进展酶法序列分析的原理

酶反应电泳方向模板CCGGTAGCAACT3´5´GG5´3´引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3´5´TCAACGATGG5´3´读出模板互补序列读出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的Sanger测序法

(酶法)

读出模板互补序列dNTP

凝胶电泳

较大片段

较小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反应混合物Klenow酶

未知序列的单链DNA

读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA5´3´

放射性标记的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3´5´CTGACTTCGACAA5´3´DNA的测序仪示意图computeranalysis凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件DNA的化学测序示意图

反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。二、DNA链末端合成终止法三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例基因文库

GeneLibrary第四节基因组DNA文库

(genomicDNAlibrary)cDNA文库

(cDNAlibrary)基因文库

(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库

第五节

生物芯片技术BiologicalChipTechnology是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一探针位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。一、基因芯片(genechip)目录基因芯片技术原理是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片第六节生物大分子相互作用研究技术

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10X凝胶迁移实验结果示意图染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七节转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。

转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术核转移技术

即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术基因剔除技术(geneknockout)也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。操作方式建立动物模型①单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变(gain-of-functionmutation)②多基因决定疾病模型四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用疾病相关基因的

克隆与鉴定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第八节克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定义

从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆应用

生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。克隆方式

①利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；

②根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。功能互补试验(functionalcomplementationassay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。

（二）定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作①

遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析②分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆（三）非定位候选基因克隆策略

由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。（四）定位候选基因克隆策