应用脱氢酶活性指标监测氯酚化合物对生物膜微生物活性的抑制作用

应用脱氢酶活性指标监测氯酚化合物对生物膜微生物活性的抑制作用摘要：本文应用脱氢酶活性研究氯酚化合物对生物膜微生物活性的抑制作用，发现氯酚化合物的正辛醇-水分配系数越大，毒性越大。过低或过高的进水有机负荷都不利于抗毒物的冲击，但有机负荷的变化并没有引起抑制效应的剧烈波动。微生态体系耐受有机毒害能力的大小为：生物膜>活性污泥；好氧污泥>厌氧污泥；水处理微生物>土壤、湖泊底泥。文中比较了脱氢酶活性、过氧化氢酶活性、呼吸速率三种指标的评价效果，结果显示，脱氢酶活性对监测有机毒物对微生物活性的抑制效应最为敏感，而过氧化氢酶活性实验重现性最低。发光菌替代水处理微生物来评价生活污水厂进水中毒性物质对生物处理的影响并不十分合适。关键词：氯酚生物膜微生物活性抑制由于目前我国的城市污水处理厂同时接受生活污水和工业废水，使得工业废水中一些对微生物具有毒害作用的物质进入二级水处理过程，造成出水水质恶化。工业企业与交通运输的突发事故形成的意外排放也会造成这种状况。现有的常规监测指标COD、BOD5和SS等只能间接地反应毒害作用发生以后出水水质的恶化程度，不能准确及时地反映进水水质的冲击效应，因而不能让污水厂操作人员有足够时间来采取应变措施，改变工艺参数，减小冲击作用。应用一些微生物学指标直接测定毒害作用发生以后的二级处理池内微生物活性的变化，则能较好地弥补这个缺憾[1]。本文主要应用脱氢酶活性指标来评价氯酚化合物对生物膜中微生物生物活性的抑制效应。1.材料与方法:1.1仪器：722光栅分光光度计，上海第三分析仪器制造厂800离心机，MAXSPEED4000r/min，金坛市中大仪器厂金怡牌水浴恒温培养箱，SHZ-88，江苏省金坛市医疗仪器厂PICO呼吸仪(DIGITALMODEL10)，英国RANKBROTHERS公司ADC-16数据处理器，PICOTECHNOLOGY发光菌测定仪，中国科学院土壤研究所接触氧化法生物膜反应器，直径30cm，有效水深0.4m，刷状填料。反应器进水为模拟生活污水。间歇充分曝气，曝气12小时，停曝12小时。1.2试剂：邻氯酚：化学纯（>99.9%），上海来泽精细化学品研究所对氯酚：化学纯（>99%），上海飞连化工厂2,4-二氯酚：化学纯（>99%），南京化学试剂厂将上述三种化合物分别配成浓度为1000mg/L的水溶液（溶解度低的化合物经超声助溶），避光放置。葡氯化三苯基四悠氮唑娘（丧TT邻C毫）膀：狂98.0砍%绝，南京生兴生呆物技术有限公拾司分装衣甲苯：分析纯字（薪>99.5异%役），南京化学议试剂一厂傍三羟基氨基甲贝烷：分析纯拿（拆>99壮%顾），江苏华康洞科技有限公司冰化学试剂厂狱过氧化氢：分兔析纯伶（络>99.5细%俩），南京化学嚼试剂一厂刚高锰酸钾：化厅学纯却（抄>97.5悔%萌）南京化学试字剂厂床发光菌冻干粉闲，由中国科学令院土壤研究所说提供抛模拟生活污水捉：践将疗16竟g居蛋白胨年、教11乳g板牛肉浸膏钟、皂0.7gN鄙aC术l脖、寇0.4gC学aCl斤2新·2H俭2霜O木、先0.2gM膛gSO屠4恒·7H挽2愿O余和拨2.8gK怕2葡HPO愉4豆溶解遮于南1始L熔水中，即得蝇到谷10午0童倍的模拟污水口（舞CO平D全为舱55000m僚g/仪L判）储备液，用技时稀释。1.3样品占如无特别说明宏，本都文凯所指生物膜取楚自某污水处理够车间（接受附绢近生活污水与帝经一级处理的置生产废水）接侧触氧化池；将恢部分生物膜连裙同刷状填料放懒在间歇反应器煮内培养，每天司曝波气叹1肯2危小时，进水采也用模拟生活污愁水。实验前将碍生物膜从填料须上敲落，并用私蒸馏水冲洗填纹料。框塔式生物滤池全内上表面生物界膜样品取自同幅一个企业污水先处理车间塔式越生物滤池，用档蒸馏水冲洗填撕料三次。笔活性污泥样品裕取自南京某污单水处理厂（接素受生活污水）的曝气池内活性塌污泥，国标法惑测停得姻MLS康S洒值刘为周1900mg吴/陪L锅。灿玄武湖东岸底阵泥，取样点水河深奏1寨m雁，实验前扯取推5聪g昂置于烧杯中，屡加吉入隆100m鹊L仓蒸馏水。狱江西红壤，壤蔑质粘土，由中偏科院土壤研究耽所提供，采自此科学院红壤生负态实验站，实凳验前翼取雪5霞g初置于烧杯中，企加争入宅100m骡L端蒸馏水。层厌氧污泥取自套某生活污水处狐理厂剩余污泥色厌氧消化池内骄，密封保存，领实验前某取旋5凶g您置于烧杯中，撒加它入则100m剪L突蒸馏水。煤生物膜、底泥抄、红壤和厌氧卧污泥样品的固仪体含量按国标我法测活性污梦泥废MLS状S即值的方法测得躺，稀释成固体和含量折为展2000mg亦/提L乓的泥水混合物玉；活性污泥样抽品浓缩陶至芹MLS的S绍为愿2000mg皇/差L吸。眯实验前，每次件取生物终膜韵-贼水混合迅液皮100m跟L监，离心后弃去昌上清液，再杠用正0.8雾5醋％生理盐硬水仍(湖4扔℃责)匠补足哗100m幅L旧，充分搅拌洗倾涤后，再次离木心弃去上清液旅；如此反复洗盲涤三次再以生纲理盐水补齐稍至章100m拴L脱，冰箱保存备荒用。劳活性污泥、湖信泊底泥、土壤稳待测样品的制津备方法同上。1.4方法粉1.4.1济脱氢酶活性的和测定，参见文登献财2桃。届途号过氧化氢酶活师性的测定，参储见文任献牢3晓。生便肺呼吸速率的测区定，参见文伴献姥4月。州西手发光菌毒性实红验，参见文异献辣5夹。1.5计算末相对脱氢酶活留性肃：茎某一化合物的桂某个浓度下相寨对脱氢酶的活暂性定义为此浓困度下该样品的割脱氢酶活性与傲同批次对照样抚（不含毒物）撕脱氢酶活性的犯比值，以百分酿比计。糖相对过氧化氢奶酶活性，相对融呼吸速率、相丑对发光强度的玻计算同上。钳2.贪是结果与讨论挤2.1尘氯大酚化合物对生恨物膜中微生物脉活性的抑制效政应幅本实验救在稀0mg/剧L春、涌10mg/纸L喉、宵20mg/丑L白、声40mg/跳L雀、无60mg/赖L膛、梅80mg/捷L透这但6多个浓度下监测硬了三种氯酚化坐合物对生活污膏水处理厂接触暗氧化池生物膜玉中微生物常温侧活性的抑制效怪应，用相对脱饺氢酶活性表示顺，如后图消1抽。菌图扮1叠愤九种取代酚类宜化合物对生物沟膜微生物活性竖的抑制效应菜实验结果表明择，对于被试氯直酚化合物，其益在生物引膜墓-近水混合系统中招的浓度越大，雄微生物的脱氢侄酶仙活性越低，即相抑制率越大。伶脱氢酶活性一项定程度上能够沾反应微生物新幻陈代谢的能力秩[携6项]龙。脱氢酶对毒姐物的作用非常指敏感，在污水渔中有毒物质存刑在时，会使酶至失活，造成水逝处理微生物活筋性的降低。研绪究者常常通过翻测定脱氢酶活地性来评价水处诉理微生物活性讽的变化强[仁7关]侦。赚将闪图肥1朝的剂量液-潜效应关系曲线翁用线性方程拟峰合，根据所得六线性方程，计废算得相对脱氢雨酶活性蒙为艺5尺0耻％时氯酚化合剥物的浓度（即句半抑制浓倦度煤EC坦50桑），凯示于碑表邮1关。漂表矩1损童氯酚化合物县的谋EC房50厨及其正辛复醇亮-踪水分配系竿数袍K柜ow旋化合芹物恐终俘EC纵50渠(涌mg/L)欢舅log霜K告ow王遮邻氯悼酚邮碑龙8档2哪扔0攻.332厕对氯舌酚副代吊4辈7乎朱0利.378鸡2,4龙-蜡二氯扯酚必逆单39遍科亩0.48静6捏表铁1辱显示蚊，笋2,4魄-柏二氯酚对生物愁膜微生物活性调的半抑制浓度统最低，邻氯酚猾的半抑制浓度弯最高借。狂三种氯酚化合站物对生物膜微辉生物活性的毒色性大小依次为荷：扇2,4卷-海二氯事酚挠>琴对氯蓬酚浅>撑邻氯酚。表中咏同时列出了三悬种氯酚化合物化的正辛醇与-威水分配系蜘数鸦K款ow现，可以看急出厦K自ow奥大的化合物对狭微生物毒性亦渐大。斩正辛归醇瘦-雾水分配系翼数牙K握ow叔是研究有机污掌染物环境归趋丙时的一个重要蚀参数，它是指义有机化合物在误正辛醇相与水葡相之间达到分面配平衡时，该核化合物在两相崖中浓度的比值船。正辛醇是一扔种长链脂肪醇企，其粪结构与生物体胡内的脂肪类似喜，因此可以模渴拟有机物在生各物相与水相间估的分配，表示暂化合物分子向习细胞内的传输誉与分配能力番[侧8挡]脊沿。有机物肆的香K通ow得值越大，其亲秤脂性越强，越桃容易在细胞内先聚集训[仪9柴]勿。实验结果证稍实，氯酚类化懂合物对生物膜割中微生物的活锐性产生抑制效计应的原因，首叮先在于其具有荣一定的亲脂性贸，能穿透细胞便膜，钝化酶并捆使蛋白质变性防。年2.2伯不同的进水有且机负荷下对氯古酚对生物膜中蓬微生物活性的自抑制效应魔在生活污水的纵生物膜处理工袜艺中，进讨水菌CO溜D妖浓度一般谷在婚200呀-娃800mg/区L忌之间。实验考膀察了在此范围息内，不同的进楚水石CO历D仗情况下，相同及剂量遥（亭20mg/L霜）库的对氯酚对生症物膜微生物活就性的抑制效应攻，如座图崭2氏所示裂。挺从图中可以看宋出，客在鸭20mg/材L葛对氯酚存在的此情况下，当进两水陆CO饭D风值谦在鹊400mg/市L弯左右的时候，裂微生物的相对丙脱氢酶活性达伟到旷70词%欣以上，抗毒物溉冲击效果最好猪。这表明过低难或过高的进水终有机负荷都不巷利于抗毒物的畜冲击。挂然而同时可以在发现图示曲线温较为平缓扮，碗进鹊水龙CO帖D焰值凉从认150mg/某L舟增大里到查600mg/咱L鄙时，相对脱氢心酶活性值只是狼在一个较小的旷范围内波动，五这表明尽管存奇在尚着涌上述较佳的抗络毒物冲击的进围水庭CO通D称范围，有机负洒荷的变化并没夺有引起抑制效表应的剧烈波动苹。识塘图嚼2边柳进航水讯CO懒D分浓度对抑制效饲应的影响覆2.3状对氯酚对不同裹微生态系统中救微生物生物活池性的抑制效应秘上文主要论述船了氯酚化合物自对生物膜中微纠生物生物活性狐的抑制效应。凶同样作为复杂笼的微生态体蓝系，活性污泥同、厌氧污泥、顷湖泊底泥和土田壤中叼的滚微生物在慧遭遇龄有机毒物时，肉其生物活性是纸否受到抑制、足抑制的程度以码及它们之间的专比较，邮是鞋本节研究的递主要内容阴。实验考察了饿常温叠下坑20mg/猾L厕对氯酚爬对宾6晌种固体浓度均吼为雪2000mg段/但L辞的不同微生态言系统微生物脱乏氢酶活性的抑另制效应，如幼图呼3售所示狮。析A=蚀弄接触氧化池内箩生物膜趴B罗＝塔式生物滤霉池内上表面生贵物膜蒸C晴＝完全混合式羞活性污泥曝气专池内活性污泥淹D令＝生活污水厂加厌氧消化池内裁厌氧污泥E＝土壤馆F熟＝湖泊浅层底喂泥村图玩3庭行对氯酚对不同蛙微生态系统微孩生物活性的抑周制效应断从鹊图蛮3芳中可以看出，彩在同样剂量的蝇对氯酚作用下由，接触氧化池锯内刷状填料上浇和塔式滤池内协上表面的生物腥膜微生物相对蔽脱氢酶活性分亩别紫为型7瘦3颈％朴和胜7改7钉％，均高于活皆性污泥中微生园物天6爆6片％的相对活性共，这证实了生幻物膜较活性污茎泥更耐受毒物绍冲击的结论。肉生物膜工艺的夏污泥龄较活性阿污泥工艺长，倍受外界影响小淘；塔式生物滤佩池的水力和有钢机负荷都较普忧通滤池高，生政物膜活性高，遣同时池内沿塔战高各层繁育着胆不同种属的生如物集群，有助湾于降解和抗冲截击；而接触氧尊化法同时具有集活性污泥法和顶生物膜法的特林点，生物膜中魄能保持较高的少生物量和生物奖活性哀[多6讯]贴。行厌氧消化污泥丧微生物相对脱优氢酶活性堪为框4线9堪％，而好氧活脸性污泥微生物股相对脱氢酶活孙性超为现6级6糖％，这表明厌茶氧微生物比好滩氧微生物对毒井物的冲击敏感辅得多。产甲烷鱼细菌是专性很码强的一类厌氧题菌，对生长环滴境（例姻如洁p驴H和值、温度、毒全性物质等）的针要求更为严格毫，其世代时间辱长微达湾4惹天以上，所以导抗冲击效果远免小于生物膜和顾活性污泥中的晌微生物凯[管6睡]缸。供从图中同时还说可以看出，土雁壤和湖泊底泥旋在同样的毒物卸冲击下，脱氢万酶活性损失不观大。两者的相萍对脱氢酶生物扑活性分别威为鞭9究3尘％爽和卖8却6咱％，高于水处曲理微生物。由硬于两者样品中需含有大量的颗狂粒无机质，当戚有机毒物进入性反应体系后，院会被土壤或底榨泥中的多孔介脂质所吸附，减蛛少了与微生物宫接触和反应的亏机会和强度，旦所以毒害作用泉表现得不充分柴。袭2.4纵不同的生物指裤标在监测氯酚易对微生物活性裁的抑制效应中坝的应用昌在水处理微生鞋物受毒害作用倡的评价中，评赛价指标的选取背是至关重要的舞。理想的评价世指标应当具有誉灵敏度高、重涉现性好的特点刊，能够正确地脾反应被试微生半物活性的变化品。誓除了脱氢酶活扬性，过氧化氢驶酶活性和呼吸裂速率也常被用督来评价毒性物巧质对水处理微庸生物生物活性提的抑制作用。籍过氧化氢酶属垒于血红蛋白酶或类，它可分解芳有机质降解过押程中向反应体致系释放的过氧榆化氢，防止其前对生物体的毒肌害作用，因此阻可用作评价污艰染状况和生物因活性的一种指认标。而好氧微招生物在降解有碑机物的同时，堪需要消耗水中齐的氧气以维持迈自身的代谢，最因此利用呼吸丧仪测定微生物纲呼吸速率的变么化，也可以考什察毒害物质对贼它的抑制作用暗[阳8咸,10]居。葛图责4狮至图拐6零为对氯酚对活淹性污泥和生物牛膜样品中微生催物生物活性抑简制推得纳效应图，分别此以相对脱氢酶昏活性、相对过译氧化氢酶活性喉和相对呼吸速宿率这三种指标满来表示相对生刃物活性。咬图役4料蜂对氯酚对微生感物过氧化氢酶骄活性的抑制效粪应毛宗粒茎鱼图肠5够峰对氯酚对微生突物脱氢酶活性尸的抑制效应荡厕座沃得图列6盟盾对氯酚对微生验物呼吸速率的呜抑制效应安上图中部的绪曲线都显示了僵很好的剂量策-际效应关系，表盯明呼吸速率、耽脱氢酶活性、割过氧化氢酶活菠性均可以谨反映筑有机毒物对微湿生物的抑制效世应粪。拨然而就敏感性词而言，这三个姥指标又各不相竿同。将上述三怖图恶中的曲线用线浑性关系式进行登相关，用所得间方程计算出相坦对活性钞为吼50至%凶时的化合物浓班度，即半抑制哭浓丸度姻EC盈50学。，见滔图乱7亲。啦灯忧A夏＝过氧化氢酶关指军标蠢满B刮＝脱氢酶指争标凑征C第＝呼吸速率指杂标态图节7貌志三种评价指标滔下对氯酚对微缓生物活性的半块抑制浓度风从上图可以看魔出，脱氢酶活滚性对监测有机甚毒物对微生物番活性的抑制效肚应最为敏感；赠过氧化氢酶某活性对毒性变强化最为迟钝捉，湿EC粘50蔽值达到或接近胡前两者的两倍也。褚海燕等人愚[11]浴通过盆炕栽玩实验和室内培脆养研究了稀土剖元素镧对红壤节微生物遮生物靠活性的影响，老表明其对土壤腊过氧化氢酶有矛轻微的抑制作桶用，而对脱氢注酶有强烈的抑妻制作用，即脱驰氢酶活性比过差氧化氢酶活性畅更能敏感地反娱应生态群落的蔬变化，滔这与本论文所战得到的脸结论撇是必一致添的盒。边在电20mg/饮L夹的对氯酚对生额物膜中微生物主生物占活性的抑制作毫用实验中，考总察了三种评价诊指标在同批次割实验中的重现只性，结果扑表阔2度所示。鬼表恋2菜倾三种微生物活续性实验的统计竿学比较（实验锯次柴数右n=盆7量）赛呼吸速率实泉验尤镇丈脱氢酶活性实臭验承争林过氧化氢酶活秘性实验秩平均浴值狮治73赏湖蠢75丘陈涨8苍3缩标准偏蒸差映踩4.5被佩县8.2槽谅丘9.态9喝从扫表马2竭可以看出，呼引吸娱法实验干的重现性最高絮，而过氧化氢盘酶活性实验重箱新性最低。赖2.5疼氯酚化合物对愤水处理微生物盘和发光菌生物看活性抑制作挽用傲EC押50邮的比较饰由于商用微生乡物（例兵如忙Microt诵ox环TM嘱、发光菌）毒利性实验的受试约对象是纯微生摧物培养液，实姑验的灵敏性和卡可重复性比起简活性污泥和生锁物膜这些复杂板微生态体系的枪毒性实验要高草得多，所以近依年来研究者尝抚试将这些商用随纯培养基的毒怒性实验数据与台水处理微生物妙的毒性实验数货据比较，以期青代替后者在污畏水厂现场进行蒙毒性的快速评制价赶[12]经。君本实验测定了探两种氯酚化合供物对发光菌发槐光强度，活性较污泥呼吸速率遮、生物膜脱氢如酶活性的半抑童制浓度，如辩表锻3搅。祝表注3环芦邻氯酚瞒和技2,4续-愧二氯酚对不同教微生物体系的连半抑制浓蚁度雾睛辱单位牧（耐mg/傍L密）炊化合窑物安臭域活性污炉泥涂(冤呼吸速西率尘)企谊生物膜（脱氢磨酶活性嗽）拣赵旨发光菌征邻氯星酚食围96邻梢建治82喉表梯23县2,4执-摆二氯旧酚搜想48咬灶旦39不右穷脏6蛇从棒表朝3押中可以看出，绢两种化合物对悉发光菌发光强唇度的半抑制浓悲度最小，相差朋达休4机倍以上。这说昏明发光菌毒性蚀实验虽然很灵缩敏，但并不能清准确地反映有浅机毒物对生物吼处理过程的影退响。发光菌等杜商用微生物用湿于替代水处理椅微生物来评价鸽生活污水厂进灿水中毒性物质丝对生物处理的亚影响并不十分貌合适。3.结论衣氯酚化合物浓绕度越大，微生拾物的脱氢酶活规性越低，即抑州制率越大倘。薯K照ow提大的化合物对伪微生物毒性亦熄大。保过低或过高的布进水有机负荷倚都不利于抗毒拆物的冲击。尽典管如此，有机济负荷的变化并堆没有引起抑制乎效应的剧烈波点动。谈微生态体系耐絮受有机毒害能己力的大小为：很生物丧膜短>吧活性污泥；好释氧污惩泥阁>裤厌氧污泥；水晶处理微生田物侍>势土壤、湖泊底剪泥。果脱氢酶活性对制监测有机毒物忆对微生物活性议的抑制效应最良为敏感，而过勒氧化氢酶活性蕉实验重新性最尊低。发光菌替节代水处理微生颂物来评价生活勇污水厂进水中厦毒性物质对生辛物处理的影响娘并不十分合适砍。参考文献泛Shijin析Ren,烦PaulD粮.Frymi碎er,Ki滋netics帅ofto膛xicity遍ofme寄talst设olumi复nescen制tbact甩eria[朽J]Adv且ances培inEnv赏ironme租ntalR潜esearc闲h,200啦3,7:53常7-547月朱南文、闵航坊、陈美慈等恋，它TT慈C枯－脱氢酶测定款方法的探学讨退[J]讨存中国沼气宫，钉1996,1皮4(2):3谱-6欲邱文芳、罗志训腾、杜仰民等帅，蛾环境微生物学在技术手讲册萄[M]朱致学苑出版社，葱北京跟，更1990莫许昭怡、张全餐兴、王连生等孩，七种萘有机吼化合物对活性典污泥的抑制作摆用雨[J]话制环境化距学盼,1999,守18(6):删538-54坝2燥程树培，环境晕生物技术实验匹指渠南进[M料]诉南京大学出版升社，南京哭，掩1995换蒋展鹏贞等茎,斧环境工程支学厚[M]的激高等教育出版惨社致,闯北勾京对,1992并H.Chua润,P.H.国F.Yu,如陵neta汗l.Sub懒-letha滔leffe织ctsof晋heavy乎metal配sona凡ctivat都edslu徒dgemi芹croorg航anisms遣.[J]迅Chemos错phere,走1999,粘39(15)宅:2681鞠-2692驾Henri遥Spanje败rset悉al.Res游ipirom赖etryi警ncont嫁rolof礼thea忆ctivat厅edslu恨dgepr吨ocess.破[J]Wa送terSc殖i.Tech懒,1996愚,34(3)破:117-1腔26吃王连生，有机闸污染物化共学巨[M遇]躲科学出版社，华北京校，氧1991否逝wy,S.劫R.Mart鸦inet滋al.Ca聪talase齿activ幼ityme嫌asurem类entsi哑nsusp毛ended绝aerobi是cbiom拨assan互dsoil堂sampl慌es.[J数]Enzy拥meand沈Micro狗bialT贺echnol染ogy,1脂999(25货):669览-676总褚海燕、朱建普国、谢祖斌等怨，换镧对红壤转化哭酶、过氧化氢齿酶和脱氢酶活捆性等影妹响涝[J]古处中国环境科学军，放2001,2隆1(1):7汗7霜-驾80璃Renan刘dPaul岗.D.Fr榆ymier.夸Compa羡rative地study良oftw普obioa冷ssays鸡forap式plicat慨ionsi窃ninfl阻uentw多astewa滚terto租xicity截monit单oring.劳[J]J遍ournal陆ofEn且vironm唯ental杰Engine蒙ering,朱2003,激129(3纳):216份-221

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