细胞因子检测1

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质，在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动，在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参疫印迹法等均已用于细胞因子的检测.疫印迹法等均已用于细胞因子的检测.因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)的促增殖作用,以增殖细胞中因子及干扰素的.感谢聆听...3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、别，常用的生物学测定法对两者都适用。IL－1的生方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞生IL－1，或用P388D1(鼠)，THP-1(人)细胞株制备IL－1。本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1.小牛血清的Hanks液(5％NBS—HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(内含腹腔细胞),反复抽吸几次.4、将腹腔细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640液 (10％NBS-RPMI-1640)配成2×106／ml,加到25、每孔用5％NBS—HBSS洗3次，弃去未粘附细6、将LPS(10μg／ml)加入巨噬细胞单层,每孔1ml，MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3－(4。ethylthiazolydiphenyl培养板中,每孔100μl。3、用PBS溶解MTT为5mg／ml，用0。22μm膜滤ml),37℃继续培养4h.5、从每孔吸出100μl上清弃去,加酸化异丙醇或加证转变的底物结晶被7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为6度对应的OD值(Y)作直线回归,按上述概率单位分析法(三)注意事项培养有时会因玻璃质量和清洗不净的污染。研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网.(一)原理选用两种针对rHuTNF—α分子不同表抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF－OD绘制标准曲线,从3、标准品:rHuTNF-α(10ng/ml)，使用时用稀4、阴性对照液(未免疫鼠Ig)。'-连氮基-双(3－乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸)。7、0．15mol／L,pH7。4PBS：配其它液体用。8、包被缓冲液：0．05mol/L，pH9.6Na2CO3-Tween0—PBS。10、稀释液:4％PEG-洗涤液(用于稀释标准品和酶标抗体)。11、底物缓冲液:0．1mol／L，pH5。0柠檬酸－磷酸氢13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,后者应作适当稀释.(三)操作步骤1、包被将稀释好的包被抗体加入ELISA板,100μ2、加待检标本洗涤液冲洗ELISA板3次,加待测样品、标准品稀释方法：取标准品150μl(10ng／ml)倍5ng/ml、2.5ng／ml、1.25ng/ml、625pg/ml、l/孔，室温或37℃显色15~30min。5、ELISA读数仪测410nm处OD值,绘制标准曲线.-70℃,避免反复冻融.4、叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用，在本实验系统中应避免使用.KH2PO40.2gNaCl8.0g双蒸水加至100mlNaCl2。9gNa2CO31．59gTween200.5mlml100ml6.ABS显色液ABTS5mg缓冲液10ml3％H2O220μl的检测，常用的方法有Southern印迹，斑点印迹,PCR，本文介绍IL—2mRNA的测定(斑点杂交法).将RNA变性工操作点样,也可其表达产物的定性及半定膜上同时进行多个样品的检测，故很适合于临床应用.亦可用于DNA的检测。但(一)主要试剂1．RNA提取试剂:TRIZOL试剂(Gibcol，No.15596－026),DEPC水(Fluka,No。980210)5.IL－2DNA探针(1)STE溶液0．1mol/LNaCl25mmol/LTris。Cl(pH8．0)(3)溶液Ⅱ0。2mol／LNaOH(临用前用10mol/L混匀内容物。于室冰乙酸11.5ml水28.5ml(5)含相应抗生素的LB培养基(6)氯霉素(0.25g/2ml)－--〉终浓度170μg/mlpH8．0)1ml(8)无水乙醇(部分—20℃预冷).异丙醇．75%乙醇(部分4℃预冷)(9)TE缓冲液(pH8.0)(11)RNA酶，RPMI－1640,胎牛血清(FCS)，ConA(刀豆蛋白A)等(二)主要仪器(三)IL－2质粒DNA探针的大量制备取含IL—2质粒DNA的单个菌落置两个25mlLB培养基(含100μg/mlAmp)取10ml菌液加200mlLB培养液(含100μg/mlA↓37℃150r/min振摇4h加氯霉素(终浓度170μg/ml)↓37℃220r／min振摇3h每管加40mlSTE溶液(冰预冷)悬浮细菌后,用移液弃上清,加5ml溶液Ⅰ(冰预冷)悬浮细菌，加1ml新配制(pH8．0)的溶菌酶(10mg/ml)加10ml溶液Ⅱ，盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混加7。5ml溶液Ⅲ(冰预冷)，轻振荡离心管数次使之↓室温5000r/min×15min离心弃上清用75％乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮),倒出乙醇，n↓室温12000rmin×10min离心(回收沉淀的核酸)乙醇洗涤沉淀，流尽乙醇,用吸纸吸去附于管壁的液滴,数分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发加入RNA酶(终浓度100μg/ml)加等体积(500μl)含13％(W／V)PEG(800)的1.6mol／LNaCl，充分混合↓12000r/min×10min离心吸上层水相移至另一EP管，加入等体积酚：氯仿：异(24:1)混匀2h或0℃2心洗涤2次↓4℃12000r/min×5min离心去上清↓↓质粒DNA10μlDW38μl2)紫外灯下切下IL—2DNA片段,挑出凝胶到EP管中,lumngsDNA(四)用DNA标记和检测试剂盒对IL-2探针进行地高地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的抗原,又称异羟基洋地黄毒甙配基,地高辛精可标记核苷酸有dig—UTP，dig-dUTP，和dig-ddUTPRNA探针，DNA探针和寡核苷酸探苷酸主要通过酶反应标记核，杂交体用特异性抗地苷酸中带有一个标记的核半抗原与碱性磷酸酶标记的个核苷酸。BoehringerMannheim公司生产的交中的应用愈来愈广泛。现介绍地高辛标记cDNA探针记十分重要.5μl对照DNA作为对照.2、将离心管置于冰上,按顺序加入下列试剂:①1μg~3μg新鲜变性DNA;②2μl六聚核苷混合物(试剂5)；③2μldNTP混合物(试剂6)，加入蒸馏水使总体积20℃)的乙醇，混匀置—70℃30min或-20℃2h，6、离心(16500r／min)，弃上清液,用50μl70％冷乙醇轻洗沉淀物.RNA)1、收集培养细胞，用RPMI—1640培养液离心洗涤2、最后一次洗涤时吸1ml细胞悬液至1.5mlEP管中,在台式离心机离心,弃上清,加入1mlTRIZOL试剂,用移液器轻轻吹打细胞数次，充分混匀,室温(15~30℃)置2~3min。4、小心吸取其中400μl移至另一Eppendorf管中，ml异丙醇，轻柔混匀,室温静置5~10min5、于2~8℃离心14600r/min×10min，在管壁(六)RNA的斑点杂交1、RNA变性:20μlRNA溶液(2μgRNA)e60℃温育30min,水浴冷却样品2、纤维素膜处理过程：硝酸纤维素膜(0。45μm)水中浸泡5min,再用20×SSC室温浸泡1h。NaOH冲液。将纤维素膜压在多下层板上，赶去气空抽吸干净后,再分别点样。如有未SSC清洗一次，待流体滤过纤min以干燥滤膜....感谢聆听...4、取出膜,80℃烤2~3h,膜保存于-20℃配20×SSC标准柠檬酸盐pH7．0NaCl175。3g用10NNaOHor10NHCl调pH至7。0,高压消毒1)预杂交液：5×SSC,0．75%(W／V)封闭剂,(W/V)SDS2)先将预杂交液热至60℃。3)将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的塑料袋,加入预杂交液,按每100cm2滤膜加20ml.气，用热封口器封住袋口，将其1)杂交液(DIGEasyHyb(20ml／100cm2)预温轻振荡30min2)将标记探针DNA(5~25ng/ml)煮沸变性5min，迅速置冰水中冷却,3)加入到预温的DIGEasyHyb(2．5ml/100cm2)中混合,避免形成汽泡4)然后每张膜上注入预杂交液和滴加探针/DIGEasy5)振荡孵育至少6h，在微量DNA时,建议16h,使其7)68℃振荡条件下,0。1×SSC,0.1％SDS清洗2(七)免疫测定1、杂交后彻底清洗,将膜置入清洗缓冲液中1~5min.2.、100ml封闭缓冲液(1×)中封闭30min。3、抗地高辛—AP复合物(75mU/ml)用封闭缓冲液(15、100ml清洗缓冲液中2次，每次15min。6、20ml测定缓冲液中平衡2~5min。9、如果可见期望的斑点，加TE缓冲液50ml作用5min终止显色(缓冲液4).AS各组积分光密度值进行比个很