病原体分子诊断技术进展

病原体分子诊断技术进展第1页，共27页，2023年，2月20日，星期一分子诊断概念和特点概念：利用标本中的核酸作为检测对象，对感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判断的方法。特点

特异性高、灵敏度高稳定性高诊断范围广、适应性强临床应用前景好第2页，共27页，2023年，2月20日，星期一什么是核酸？链状分子DNA(脱氧核糖核酸)

贮存遗传信息RNA(核糖核酸)

传递遗传信息遗传信息的传递途径DNARNA蛋白质转录逆转录第3页，共27页，2023年，2月20日，星期一DNA和RNA的区别糖基+Base

Nucleoside+Phosphate

PNucleotideA、DNA和RNA的主要区别就在骨架上的糖基。B、DNA很稳定，RNA不稳定。第4页，共27页，2023年，2月20日，星期一RNA和DNA的结构dsDNAssDNAssRNA第5页，共27页，2023年，2月20日，星期一通常RNA在细胞中拷贝数远高于DNA的拷贝数一个或几个拷贝DNA可达10000个拷贝的核糖体RNA(rRNA)OneCellContains:第6页，共27页，2023年，2月20日，星期一如使用rRNA为靶标，将极大地提高了

取样效率和扩增检测灵敏度A、如果2ml样本含有1个细菌

取0.2ml样本，最终得到细菌的几率是1/10。SampleCellLysisTargetRNAReleasedB、如果2ml样本含有1个细菌先裂解，后取样，

2ml样本含有10000个rRNA。取0.2ML样本，可得到1000个分子第7页，共27页，2023年，2月20日，星期一主要的核酸扩增技术DNA扩增技术A、PCR：使用Taq酶进行扩增，温度循环；RT-PCR将RNA变成DNA，再进行DNA扩增B、实时荧光PCR：扩增与PCR相同，采用实时闭管荧光检测（分子信标，Taqman探针等）RNA扩增技术A、TMA：恒温扩增，使用RT酶和T7酶；终点杂交保护检测B、SAT：扩增与TMA相同，采用实时闭管荧光检测（分子信标）第8页，共27页，2023年，2月20日，星期一实时闭管荧光检测常见技术第9页，共27页，2023年，2月20日，星期一PCR原理第10页，共27页，2023年，2月20日，星期一Real-TimePCR第11页，共27页，2023年，2月20日，星期一TMA原理第12页，共27页，2023年，2月20日，星期一SAT原理（实时荧光TMA）第13页，共27页，2023年，2月20日，星期一SAT与PCR技术原理比较

RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分钟内扩增1010倍第14页，共27页，2023年，2月20日，星期一DNA扩增技术（PCR）用于病原体

检验的不足

不能区分“活菌”“死菌”与临床相关性差不能区分“潜伏感染”“活动性感染”临床意义小，如CMV交叉污染变温检测，对仪器要求高反应易受抑制第15页，共27页，2023年，2月20日，星期一RNA扩增技术用于病原体

检验的优势可以区分“死菌”“活菌”：病原体死亡，RNA很快降解与临床相关性好（＝培养），减少无效治疗，比如抗生素滥用可以诊断“活动性感染”

活动性感染：指示RNA转录活跃潜伏感染：指示RNA不转录不易污染：靶标和扩增产物都是RNA灵敏度高：RNA拷贝数≥DNA拷贝数第16页，共27页，2023年，2月20日，星期一RNA诊断产品的商品化程度及应用FDA或CE认证产品（TMA）SFDA认证产品（SAT）沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）结核分子杆菌（TB）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）......为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（一）第17页，共27页，2023年，2月20日，星期一为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（二）血液筛查市场美国中国RNA诊断RNA诊断传统技术传统技术其他传染病市场（优生优育：CT/NG为例）RNA诊断传统技术传统技术美国中国100%进口！有部分国产第18页，共27页，2023年，2月20日，星期一RNA用于TB的检测（TMA）进入多国诊疗指南1996：美国CDC首个NAAT技术在TB实验室诊断的应用的指南——TMA通过FDA认证，配合培养法对涂阳患者进行诊断2000：美国CDC更新NAAT法在TB实验室诊断中应用的指南——TMA用于TB疑似患者(涂阳、涂阴)痰液检测、PCR用于TB涂阳患者的痰液检测2007：加拿大卫生部TB诊断标准为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（三）第19页，共27页，2023年，2月20日，星期一什么样的病原体需要分子诊断？传统方法不能及时检测或鉴定的病原体。

难培养的如CT、MG、手足口病毒培养较慢的如TB镜检容易弄错的如NG、T.vaginalis免疫交叉反应较多的如CT需要分型的如HPV、HSV胞内病原体如衣原体、支原体、病毒第20页，共27页，2023年，2月20日，星期一与PCR、TMA等相比，SAT改进了捕获方法（一）靶标核酸捕获核酸磁珠OligodTOligodA优点：几乎去除了所有抑制剂允许使用大体积样本可同时处理多种样本第21页，共27页，2023年，2月20日，星期一与PCR、TMA等相比，SAT开发了全自动样本处理方法（二）全自动样本处理工作站特点不需要任何样本前处理国内唯一全自动尿样（血样等）处理系统1.5小时，96个样本（RDMag-96）样本提取反应液制备一体化第22页，共27页，2023年，2月20日，星期一SAT应用例一（CT/NG尿液检测，国内唯一）CT/NG尿液检测CT女性感染人群中70%以上无临床症状男性感染人群中50%无临床症状NG女性感染人群中60%无临床症状男性感染人群中20%无临床症状CT的反复感染不仅导致不育，而且增加感染淋球菌、HIV、HBV等风险（6～8倍）【1】【1】李跃进,谭湘芳.荧光定量PCR检测性病的结果分析[J].实用医技杂志,2007,14(16):2151.第23页，共27页，2023年，2月20日，星期一RNA（TMA）检测尿液中的CT（美国）尿液样本的灵敏度、特异性与拭子相当SystematicReview:NoninvasiveTestingforChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeae.AnnInternMed.2005;142:914-925.第24页，共27页，2023年，2月20日，星期一SAT国内数据检测样本量：1050例CT-SAT拭子尿液NG-SAT拭子尿液CT感染拭子和尿液灵敏度对比NG感染拭子和尿液灵敏度对比第25页，共27页，2023年，2月20日，星期一SAT应用例二（结核分枝杆菌检测）操作流程痰液预处理超声波处理15min预热15min恒温扩增40min耗时2小时第26页，共27页，2023年，2月20日，星期一1、以临床诊断的结果为金标准，对253例结核患者痰标本；134例其他呼吸道感染患者标本同时进行涂片、TB-SAT、BactecMGIT960检测。参数方法临床诊断灵敏度(%)特异度(%)阳性预测值(%)阴性预测值(%)阳性阴性TB-SAT总样本阳性171067.610010062.0阴性82134涂片阳性阳性120097.610010040.0阴性32涂片阴性阳性51039.2