癌生物学第五课p与凋亡

癌生物学第五课p与凋亡第1页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity一、p53的发现：P53与凋亡F9：胚胎肿瘤细胞SV40：多乳头瘤病毒T：SV40转化仓鼠血清N:普通仓鼠血清P53在两种不同的转化细胞中高表达（1979）1979年，研究人员发现突变型p53常见于肿瘤。1993年，该年被称为“p53分子年”第2页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity二、p53是肿瘤抑制基因P53与凋亡编码Ras癌蛋白的cDNA与7种不同形式的p53cDNA共转染大鼠胚胎成纤维细胞第3页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity二、p53是肿瘤抑制基因P53与凋亡P53不能被简单认为是正常发育中细胞增殖的普通负调节者，实际上p53更像是专门阻止非正常细胞的出现，尤其是那些有可能发展为肿瘤的细胞P53-/-小鼠胚胎发育和出生存活率不受影响，但在生命的相对早期死亡率相当高，大部分死于肿瘤，如肉瘤和白血病P53+/-杂合小鼠大约在250天左右发生肿瘤P53+/+小鼠在500天中没有出现死亡第4页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity二、p53是肿瘤抑制基因P53与凋亡至2002年，数据显示在30-50%的人类肿瘤中都存在P53基因的突变实际上，在迄今所有人类肿瘤细胞基因组中，p53是发生突变频率最高的P53等位基因在人类肿瘤细胞中突变的频率第5页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity三、突变的p53影响正常p53的功能P53与凋亡多大多数与肿瘤相关的突变p53等位基因（75%）都在可读区存在错义密码子（导致氨基酸的改变），而不是无义密码子（导致多肽链过早终止）第6页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity肿瘤细胞在p53蛋白发生轻微改变的情况下，比它完全缺失更获益，如通过无义突变或直接删除p53基因的重要部分而形成无效等位基因三、突变的p53影响正常p53的功能P53与凋亡人类肿瘤超过15000个p53的突变等位基因被测序，大多数是点突变。其中95.1%的突变影响着p53蛋白的DNA结合结构域第7页，共42页，2023年，2月20日，星期一p53基因杂合细胞中，15/16的蛋白质都缺乏完整的正常功能突变的p53蛋白是如何促进肿瘤细胞的形成？三、突变的p53影响正常p53的功能P53与凋亡背景线索：1）有意义的突变使编码的基因产物失活；2)这个突变使得突变等位基因能够干扰或妨碍细胞中剩下的野生型拷贝的正常活性（这种类型的等位基因被命名为差异显性干扰或者显性负等位基因）3）p53是一个核蛋白，以同源四聚体（4个相同的多肽亚基）的形式存在于细胞中推论：突变的p53等位基因可以有效地干扰在同一个细胞中表达的野生型p53等位基因。甚至只含有一个突变型的蛋白质亚基都可能导致整个四聚体的功能受损第8页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity四、p53的半衰期短：P53与凋亡P53的核定位提示该蛋白可能作为一个转录因子而起作用，第一种机制，p53蛋白水平的改变是主要的背景：目前已知的三种调控核转录因子活性的机制：1）调控转录因子在核内的水平2）转录因子在核内的水平保持恒定，但其活性必须由一些共价修饰复制3）调控某个共同转录因子水平一种抑制蛋白质合成的药物：放线菌酮，能够用来区分相对稳定的蛋白（合成后能持续数十到数百小时）和代谢高度不稳定的蛋白（一合成就被降解）。野生型p53蛋白的半衰期大约是20min，说明p53是高度不稳定的蛋白。为什么细胞要浪费能量和物质来合成这么一个高度不稳定的蛋白？生理信号刺激细胞增加或降低某种蛋白的水平，可以通过调控编码mRNA水平或mRNA的翻译速率来完成。但对于某个关键的蛋白更为迅速的调控可以通过增加或者降低其稳定性来完成。如p53蛋白浓度可以通过抑制降解使其在20min内加倍第9页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity五、诱导p53的信号P53与凋亡细胞中存在很多负责监控细胞系统完整及功能的传感器，当检测到损伤或异常时，将信号传递给p53及其调节器，导致细胞p53水平快速升高不可逆可逆第10页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity五、诱导p53的信号P53与凋亡X线照射后，，p53、p21Cip1蛋白水平升高，从而抑制CDK导致细胞周期阻滞，但在p53突变的细胞中则不发生。因此，携带突变p53等位基因的细胞与野生型细胞相比，同时暴露于应激原时，进入细胞阻滞或者凋亡的倾向明显要小第11页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity五、诱导p53的信号P53与凋亡小结P53持续接受多种监控系统传出的信号；如果p53接受到特殊的警告信号，它将阻止细胞的增殖或者启动凋亡程序P53的抑制细胞生长和促进细胞凋亡的功能，对于向恶性生长期进展的初期肿瘤细胞是一个主要威胁应激、DNA损伤、信号通路失调是肿瘤各个时期都会经历到，因此一个完整的p53警告系统对肿瘤构成威胁大多数或者可能所有的人类肿瘤细胞的p53警报系统必须部分或全部失活没有完整的p53，肿瘤细胞可以忍受缺氧、DNA损伤及生长调控通路的失调正常细胞则需要避免p53过度激活第12页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity六、DNA损伤及失调的生长信号导致p53稳定P53与凋亡损失或信号失衡，监控系统将发送报警信号给p53，有三个研究较清楚的监控系统：1）对染色体DNA双链断裂应答：基因组中任何一个位置的双链断裂都足够引起p53水平的上调，只是不清楚那种蛋白检测到了断裂，但知将信号传递给p53的是ATM激酶（和ATR激酶），使p53磷酸化而不被降解。2）对DNA损伤因子的应答：包括某些化疗药物、紫外线照射及某些蛋白激酶抑制剂。ATR激酶将信号传递给酪蛋白激酶（CKII），后者磷酸化p533）异常的生长信号，特别是pRb-E2F控制的细胞周期发生紊乱0第13页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity七、Mdm2和ARF为p53的命运而战P53与凋亡Mdm2最初在鼠肉瘤细胞中发现，由细胞染色体中的双微体（double-minutechromosome）编码。在许多人类肺癌中，Mdm2都是过表达

P53蛋白是由泛素蛋白酶体系统降解

正常情况下，p53的降解由Mdm2(小鼠）和HdmI（人）的蛋白调控，介导泛素与p53连接并将p53从核内转运到细胞质的蛋白酶体中Mdm2连续而高效的运作保证了p53在正常未受刺激细胞中20min的半衰期

细胞遭遇某些类型刺激或者损伤，p53通过磷酸化来免除Mdm2对它的降解，Mdm2不能与磷酸化的p53结合，不能使其泛素化Mdm2和p53生死相连第14页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity七、Mdm2和ARF为p53的命运而战P53与凋亡ARF：Mdm2的拮抗物，p53敌人的敌人，是重要的抑制肿瘤的基因在小鼠为p19ARF（p16INK4A),在人为p14ARF，后被命名为ARE基因ARF与Mdm2结合并抑制其功能，快速诱导p53的上调在多种保留着野生型的p53拷贝的人类肿瘤中，通过失活两个编码ARE的基因拷贝来去除p53的功能多种激酶控制p53水平第15页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity七、Mdm2和ARF为p53的命运而战P53与凋亡ARF与p53的同盟第16页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity八、ARF和p53介导的凋亡通过监控胞内信号来监控肿瘤P53与凋亡第17页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity九、p53:基因组的忠实守护者P53与凋亡p53作为转录因子来阻断DNA损伤后细胞周期进程以及参与修复过程，p53蛋白有一个DNA结合结构域p53四聚体还需要经过复杂的共价修饰（C端），包括乙酰化、糖基化、磷酸化、核糖基化和sumo化突变的p53基因导致p53蛋白丧失转录激活能力，最直接的就是不能诱导Mdm2的转录及合成，使p53逃脱降解并累积染色体DNA受损伤后，P53蛋白通过阻止细胞周期的进程和DNA的复制、诱导表达DNA修复酶，减少细胞基因组中突变累积的比率P53的突变或缺失，可导致基因组中错误的积累第18页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversityP53靶基因举例P53与凋亡基因类型基因名称基因产物功能P53拮抗基因MDM2/HDM2诱导p53的泛素化生长阻滞基因p21CiplCDK抑制剂、DNA聚合酶Siah-1Beta-catenin降解14-3-3将cyclinB-CDC2束缚于胞质中ReprimoG2期阻滞DNA修复基因p53R2核苷酸还原酶-DNA前体的合成XPE/DDB2GlobalNERXPCGlobalNERXPGGlobalNER,TCRGADD45GlobalNER?DNApolk易出错的DNA聚合酶第19页，共42页，2023年，2月20日，星期一P53靶基因举例NanjingUniversity凋亡调节子BAX线粒体孔蛋白PUMABH3线粒体孔蛋白NOXABH3线粒体孔蛋白p53AIP1去除线粒体膜电位KillerlDR5细胞表面死亡受体PIDD死亡结构域蛋白PERP促凋亡转膜蛋白APAF1Caspase-9的激活子NF-kB转录因子参与TNF信号通路FaslAPO1死亡受体PIG3线粒体氧化/还原调控PTEN降低抗凋亡的PIP3水平Bcl-2（抑制）其表达IGF-1R（抑制）其表达IGFBP-3IGF-1拮抗抗蛋白TSP-1(thrombospondin)血管生成拮抗剂第20页，共42页，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53与凋亡半胱氨酸天冬氨酸酶剪切细胞骨架蛋白：肌动蛋白、网格蛋白、弹性蛋白、凝溶胶蛋白使细胞骨架塌陷半胱天冬酶剪切核膜内表面的纤层蛋白，导致染色质凝集和核固缩半胱天冬酶活化并剪切脱氧核糖核酸酶的抑制剂（ICAD）最终导致DNA降解自然死亡小体第21页，共42页，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53与凋亡第22页，共42页，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53与凋亡第23页，共42页，2023年，2月20日，星期一问题：p53是如何在抑制细胞生长、阻碍细胞周期进程和激活细胞程序性凋亡之间进行选择的？P53与凋亡第24页，共42页，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53与凋亡p53引起的凋亡常限于非常规的，即威胁到细胞及组织的紧急情况。如肿瘤的发生，p53启动的凋亡是生物体清除有潜在成瘤能力细胞的一种方法第25页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十一、p53的失活对初始癌细胞在肿瘤进行发展的多个阶段起着重要的作用P53与凋亡肿瘤形成的早期阶段，癌基因常通过不同形式的突变活化，容易引起p53诱导的凋亡。因此，具有这样一个癌基因的细胞如果减弱了p53的功能，就能具备更强的生长优势第26页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一个依赖线粒体的复杂过程P53与凋亡P53仅仅是引起程序性死亡的作用者之一，凋亡还可以不依赖于p53，如失巢凋亡。Caspase3阳性细胞（失巢）附着于整联蛋白的存活乳腺细胞（显示胞核）第27页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一个依赖线粒体的复杂过程P53与凋亡bcl-2(B-celllymphomagene-2),是最早知道的调节凋亡基因。bcl-2

能够延长本来会迅速死亡细胞的寿命。myc癌基因，单独作用时能有效促进细胞分裂，但其生长能力却被它的死亡诱导能力减弱，若bcl-2和myc同时作用，能使细胞具有更强的恶性行为myc的死亡诱导作用能被p53基因的失活而中和不同转基因小鼠死于淋巴瘤的时间第28页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一个依赖线粒体的复杂过程P53与凋亡Bcl-2癌蛋白在胞内发挥作用的场所是线粒体外膜，调控线粒体介导的凋亡。细胞色素C位于线粒体外膜和内膜之间，起着传递电子的作用。一旦凋亡信号开始，细胞色素C会脱离线粒体进入胞质，并联合其它蛋白启动凋亡级联事件第29页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一个依赖线粒体的复杂过程P53与凋亡细胞色素C位于线粒体外膜和内膜之间，起着传递电子的作用。一旦凋亡信号开始，细胞色素C会脱离线粒体进入胞质，并联合其它蛋白启动凋亡级联事件A起始时，细胞色素C与线粒体分布一致B-D当凋亡进展时，细胞色素C从线粒体释放，在胞浆中的染色变得均匀，同时胞核出现与凋亡相一致的断裂第30页，共42页，2023年，2月20日，星期一十二、凋亡是一个依赖线粒体的复杂过程P53与凋亡Bcl-2家族成员：右图BH3-only蛋白活性可以通过：转录、胞内定位、蛋白水解切割或磷酸化调节跨膜锚定区Bax家族成员常以无活性的方式存在于线粒体外膜或细胞浆中；BH3-only家族的无活性成员只存在于细胞质。它们都被促凋亡信号活化或易位至线粒体中第31页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一个依赖线粒体的复杂过程P53与凋亡Bcl-2家族成员间的调节抑制Bcl-XL的功能第32页，共42页，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一个依赖线粒体的复杂过程P53与凋亡Bax（不可见）/Bak（黑色颗粒）在线粒体外膜上的聚集，导致线粒体断裂，细胞色素C的释放第33页，共42页，2023年，2月20日，星期一P53与凋