医学分子生物学(全套课件633P)

医学分子生物学MedicalMolecularBiology第一章

绪论Introduction第一节分子生物学和医学分子生物学研究的主要内容一、分子生物学的主要内容（一）生物大分子核酸和蛋白质的结构与功能（二）基因组的结构与功能（三）基因组的复制、表达和调控（四）生物大分子的互相作用（五）细胞信号转导（六）分子生物学技术二、医学分子生物学的主要内容（一）人体发育、分化和衰老的分子生物学基础（二）细胞增殖的分子基础（三）人体三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础（四）基因的结构异常或表达异常与疾病的关系（五）应用分子生物学技术进行基因诊断、基因治疗、生物制药和卫生防疫。第二节分子生物学的发展史一、分子生物学的形成二、分子生物学的发展第三节分子生物学在医学中的应用一、人体发育调控和人体功能调控的分子生物学基础二、基因与疾病三、生物工程与生物制药四、预防医学第三章基因组的结构与功能StructureandFunctionofGenome基因（gene)：

是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。基因组（genome）：

细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和称为基因组。结构基因（structuralgene）：

是指能转录生成RNA或编码多肽链的DNA序列。假基因（pseudogene）：

是指与功能正常的基因序列相似，但无转录功能，或转录产物无功能的基因。断裂基因（splitgene）：又称为不连续基因，即由内含子（非编码序列）和外显子（编码序列）组成的基因。多数真核生物基因为断裂基因。非剪接基因（non-splicinggene）：

又称为连续基因，即无内含子序列的基因，转录产物无须剪接，可直接用来翻译合成蛋白质。原核生物基因和少数真核生物基因为非剪接基因。重叠基因（overlappinggene）：相邻两个或几个基因之间在序列上有重叠现象，这种基因称为重叠基因。基因家族（genefamily）：功能相关的基因构成各种基因家族。第一节病毒基因组VirusGenome病毒（Virus）的组成病毒virus核衣壳nucleocapsid包膜（来自宿主细胞膜）

envelope

核酸Nucleicacid衣壳capsidDNARNA（由蛋白质排列构成）病毒（Virus）的结构球状病毒的衣壳多具有二十面对称结构病毒衣壳二十面对称结构Schematicdiagramofhuman

immunodefiencyvirus（HIV）包膜蛋白包膜核酸衣壳核衣壳杆状病毒衣壳为螺旋对称结构RNAProteinsubunit烟草mosaic

病毒一、病毒基因组核酸的主要类型双链DNA单股正链DNA双链RNA单股负链RNA单股正链RNA1、双链DNA

环状DNA线状DNA这类病毒基因组DNA复制的类型：（1）通过DNA复制过程完成基因组复制。大多数DNA病毒基因组属这种类型。（2）先转录生成RNA中间体，然后再通过逆转录过程完成基因组的复制。如乙肝病毒（hepatitisBvirus,HBV）。

核酸分子的正链与负链：

序列与mRNA相同的核酸链，称为正链；与mRNA互补的核酸链，称为负链。GAATCGTTACCGCGCATAGTTGGCCTTAGCAATGGCGCGTATCAACCGGAAUCGUUACCGCGCAUAGUUGGCmRNADNA负链正链CUUAGCAAUGGCGCGUAUCAACCG负链RNAHBV-DNA的复制机制正链负链线状双链DNA带有部分单链区的环状双链DNA共价闭环双链DNA闭环以负链为模板进行转录翻译合成核衣壳蛋白逆转录前基因组RNA核衣壳RNA酶H也可整合入宿主细胞染色体中2、单链正股DNA这类病毒包括自主微小病毒、依赖微小病毒、M13噬菌体。解链复制复制正股DNA负股DNA双股DNA正股DNA复制翻译病毒蛋白质转录RNA包装成病毒颗粒负链正链可降解负股DNA正股DNA特点：

①进入宿主细胞后复制形成双链，并通过DNA复制过程完成基因组的复制；

②其基因转录方式类似于真核细胞，即以负链为模板转录生成mRNA。3、双链RNA

动物呼肠孤病毒和各种噬真菌体属于这类病毒。CUUAGCAAUGGCGCGUAUCAACCGGAAUCGUUACCGCGCAUAGUUGGC特点：①通过RNA复制过程完成基因组的复制；②以负链RNA为模板转录生成mRNA。4、单链负股RNA特点：①进入宿主细胞后复制形成双链RNA，并通过RNA复制过程完成基因组的复制；②复制形成的正链RNA无5`帽和3`polyA结构，不能作为合成蛋白质的模板；③以负链RNA为模板转录生成带有5`帽和3`polyA的mRNA，可翻译生成病毒蛋白质。5、单链正股RNA这类病毒基因组的复制和转录机制有两种：（1）通过RNA复制过程完成基因组的复制；正股RNA既可以作为mRNA，翻译合成蛋白质，也可以包装形成病毒颗粒。（2）通过DNA中间体完成基因组复制。转录逆转录复制整合翻译合成病毒蛋白质包装形成病毒颗粒病毒RNAcDNA双链DNA宿主DNA前病毒二、病毒基因组结构与功能的特点1、不同病毒基因组大小相差较大病毒基因组大小（kb）RNA病毒小RNA病毒科

7.2~8.4披盖病毒科12黄病毒科10DNA病毒乙肝病毒3.2痘病毒300

2、不同病毒基因组可以是不同结构的核酸病毒基因组的类型乳头瘤病毒闭环双链DNASV40病毒闭环双链DNA腺病毒线状双链DNA疱疹病毒线状双链DNA噬菌体M13单链环状DNA脊髓灰质炎病毒单链RNA呼肠孤病毒双链RNA

3、病毒基因组有连续的也有不连续的病毒基因组核酸分子连续性数目DNA病毒连续1冠状病毒连续1小噬菌体Q连续1流感病毒不连续8呼肠孤病毒不连续10

4、病毒基因组的编码序列大于90%5、除逆转录病毒基因组有两个拷贝外，其他病毒基因组都是单倍体。HIV6、病毒基因有连续的和间断的间断基因连续基因内含子外显子编码病毒的各种衣壳蛋白基因7、相关基因丛集转录转录后加工多顺反子mRNAmRNA8、基因重叠A基因B基因

9、病毒基因组含有不规则结构基因（1）几个结构基因的编码区无间隔；（2）mRNA没有5`端的帽子结构；（3）结构基因本身没有翻译起始序列。三、典型病毒基因组介绍（一）SV40病毒（猴空泡病毒40）基因组晚期转录区早期转录区TtVP1VP3VP2OriSV40病毒基因组早期基因转录区晚期基因转录区T抗原基因t抗原基因VP1VP2VP3调控区复制起始点启动子增强子（二）乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）基因组

HBV基因组是由正负两条链组成的带单链区的环状DNA分子，分子中的重要成分有：

1、顺向重复序列（DR）:DR1,DR22、S区段：S基因、前S1基因、前S2基因

3、C区段：编码HBcAg4、P区段：编码逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）

5、X区段：编码的X蛋白功能不详

DR2DR1TPPrimer(—)strand(+)strandPres1Pres2SPpolyAPreC/CXPres1Pres2/5RCPreCCX（三）逆转录病毒基因组5`-帽-R-U5-PB--DLS--gag-pol-env-(onc)-C-PB+-U3-R-poly(A)n-

3`HIV-1HIV-2progp1205`-polintgp41-3`LTRgagRNaseHvptviftatvputatrevLTRnefpolprogp1205`-polintgp41-3`LTRgagRNaseHvpxvifvprtatrevLTRnefpolenvRREenv第二节原核生物基因组

ProkaryoteGenome一、原核生物基因组结构与功能的特点

1、基因组通常仅由一个环状双链DNA分子组成；大肠杆菌染色体的类核结构环状DNA类核中央2、基因组中只有一个复制起始点；双向复制3、具有操纵子结构IPOZYAImRNAIPOZYA阻遏蛋白ImRNARNA聚合酶-半乳糖苷酶乳糖透性酶半乳糖苷乙酰化酶多顺反子mRNA

4、编码顺序一般不会重叠,只有少数基因存在重叠现象；

5、基因是连续的，无内含子；因此，转录后不需要剪切；

6、编码区在基因组中所占比例（约50%）远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组；非编码区主要是一些调控序列；

7、基因组中重复序列很少；

8、具有编码同工酶的基因；

9、存在可移动序列，包括插入序列和转座子；

10、具有多种功能的识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录起始区、转录终止区等。二、质粒（plasmid）（一）概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独立进行复制的环状DNA分子。（二）质粒的遗传控制

1、复制调控系统：控制质粒的拷贝数。Orirep基因cop基因复制调控系统

2、分配系统：使质粒在细菌细胞分裂过程中精确分配到子细胞中。质粒中发挥这种作用的区域称为分配区。

3、细胞分裂控制系统：抑制细胞分裂，使细胞分裂与质粒复制协调，避免太多不含质粒子细菌出现。

4、位点特异重组系统：控制质粒在细菌细胞内的多聚体与单体相互转变过程。位点特异重组系统att位点Int酶Xis酶FIS因子IHF因子质粒自身提供宿主提供

5、质粒的不相容性：具有相同复制起始点和分配区的两种质粒不能共同存在于同一个细菌细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。（三）质粒的类型

1、接合型质粒、可移动型质粒和自传递质粒

2、严谨型质粒和松弛型质粒

3、窄宿主谱质粒和广宿主谱质粒三、转位因子（transposableelement）（一）概念：

转位因子，即可移动的基因成分，是指能够在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。在细菌中，则指可在质粒和染色体之间或在质粒和质粒之间移动的DNA片段。（二）转位因子的类型及其特征转位因子插入序列转座子可转座的噬菌体

1、插入序列（insertionsequence,IS）特征：（1）是一类较小的没有表型效应的转座因子，长度约700~2000bp；（2）由一个转位酶基因和两侧的反向重复序列（invertedrepeatsequence,IR）组成；（3）可双向插入靶位点，在插入后的两侧可形成顺向重复序列（directrepeatsequence,DR）插入序列IRIR转位酶基因IR---GAATTCGGCTTAAG------CTTAAGCCGAATTC------GAATTCGGAATTCG------CTTAAGCCTTAAGC---DR2、转座子（transposon,Tn

）（1）特征：

①是一类较大的可移动成分；

②含有关转座的基因，如转座酶；

③带有一个或几个与转座作用无关的但可决定宿主菌遗传性状的基因，如大肠杆菌毒素Ⅰ基因、抗药性基因等。（2）类型①复合型TnIR或类IR转座酶基因两侧臂结构基因序列②TnA族转座酶（TnpA）阻遏和解离蛋白质（TnpR）-内酰胺酶反向序列内解离区Tn3的结构③接合型Tn

一类可以在细菌间通过接合进行转移的Tn；

无末端反向重复序列，转座后不产生顺向重复序列；转座方式类似-噬菌体整合的专一性重组。3、可转座的噬菌体（transposablephage）是一类具有转座功能的溶源性噬菌体。（三）转位作用的机制受体DNA供体DNA靶位点转座子第三节真核生物基因组

EukaryoteGenome一、真核生物基因组结构与功能的特点

1、每一种真核生物都有一定的染色体数目，除配子（精子和卵子）为单倍体外，体细胞一般为双倍体；如:

果蝇8条（4对）小鼠40条（20对）人46条（23对）

2、真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一；如：大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。人类染色体单倍体DNA全长3×109bp，含3~4万个基因。

3、真核生物基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子；内含子外显子启动子增强子5`-UTR3`-UTR增强子真核生物结构基因及其主要调控元件

UTR:非编码区；增强子可以位于基因的上游或下游较远处

4、真核生物基因组中含有大量重复序列；

5、真核生物基因内非编码序列占90%；

6、真核生物基因大多数为断裂基因；

7、功能相关的基因构成各种基因家族

8、真核生物基因组中也存在可移动的遗传因素——转座子。二、真核生物基因组的结构结构基因顺式调控元件基因家族重复序列转座子端粒（一）结构基因——断裂基因内含子外显子hnRNA

mRNA（单顺反子）转录转录后加工（二）顺式调控元件（cis-actingelements）启动子上游启动子元件增强子沉默子（负增强子或抑制子）反应元件加尾信号1、启动子（promoter）（1）启动子是RNA聚合酶特异识别和结合的DNA序列，位于基因转录起始点的上游，具有启动基因转录的作用，但本身不被转录。（2）真核生物基因启动子原件——TATA盒。（3）上游启动子元件——CAAT盒、CACA盒、GC盒等。2、增强子（enhancer）（1）DNA中某些序列与相应的反式作用因子结合后，可增强启动子的作用，提高基因的转录活性，这些序列被称为增强子。（2）增强子可位于结构基因的上游或下游，距离启动子可远可近，其作用通常与方向和距离无关。（3）没有增强子，启动子通常无活性；没有启动子，增强子也无法发挥作用。（4）通常可决定基因表达的时间特异性和组织细胞特异性。3、负增强子（negativeenhancer）或沉默子（silencer）

DNA中某些序列与特定的反式作用因子结合后，可抑制启动子的作用，降低基因转录活性，这些序列被称为负增强子。4、反应元件（responseelements）

一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与DNA的特异序列结合，调控基因的表达。这种特异的DNA序列被称为反应元件。如：热休克反应元件（heatshockresponseelements）

糖皮质激素反应元件（glucocorticoidresponseelements）5、加尾信号AAUAAA(GU或U)n加尾信号（三）基因家族（genefamily）类型：1、核酸序列相同。如rRNA基因家族、tRNA基因家族、组蛋白基因家族等。2、核酸序列高度同源。如人类生长素基因家族。3、编码产物具有同源功能区。如

src癌基因家族。4、编码产物具有小段保守基序。如DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）盒基因家族。5、基因超家族（genesuperfamily）。如免疫球蛋白基因超家族。（四）重复序列1、高度重复序列：重复次数>105

类型：

卫星DNA

反向重复序列2、中度重复序列：重复次数10~105

如rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因、免疫球蛋白基因等。3、单拷贝序列：仅出现一次或少数几次。（五）转座子转录逆转录整合逆转录转座子（六）端粒端粒区端粒下区着丝点端粒区端粒下区染色体GGG(TTAGGG)nCCC(AATCCC)n人DNA端粒结构重复单位重复次数GGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAU5`3`端粒酶作用机理三、人类基因组的组织结构特征人类基因组具有上述真核基因组的基本结构特点。此外，最为突出的特征是：

基因组的DNA总量约3×109，其中编码序列占5%以下，非编码序列占95%以上。非编码序列中存在大量重复序列。人类基因组的DNA序列多态性（一）人类基因组的重复序列反向重复序列串联重复序列散在重复序列1、反向重复序列（invertedrepeats）AGCTAGTACATGCATGCGTACTAGCTTCGATCATGTACGTACGCATGATCGA反向重复序列（中间无间隔的又称为回纹结构）CAGTAGTACTAGCTTGCCATGATCGAAGCTAGTACTCGATCATGTACGTGCA反向重复序列易形成链内碱基配对而呈“发夹”式或“+”字形结构2、串联重复序列（tandemrepeats）重复序列的重复单位成串排列。（1）编码区串联重复序列如组蛋白基因。ACAATT-ACAATT-ACAATT…ACAATT……（2）非编码区串联重复序列

①大卫星DNA②小卫星DNA③微卫星DNA3、散在重复序列Interspersedrepeats（1）短散在重复序列（shortinterspersednuclearelements,SINEs）。如Alu家族（灵长类特有）。（2）长散在重复序列（longinterspersednuclearelements,LINEs）。如KpnⅠ家族。（一）人类基因组的DNA多态性同种生物的不同个体之间基因组DNA序列的差异性，称为基因组DNA的多态性。1、位点多态性（DNAsitepolymorphism）

位点多态性也称为基因多态性，即指在人群中的同一基因位点上有多个等位基因。2、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）

由于DNA多态性可引起某种限制性内切酶酶切位点的消失或新位点出现，因此应用同一种限制性内切酶消化不同个体的DNA时，会得到长度各不相同的限制性酶切片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。MstⅡAB1.3kp1.1kp0.2kpMarker3、串联重复多态性（tandemrepeatpolymorphism）（1）小卫星DNA多态性（2）微卫星DNA多态性第八章基因工程GeneticengineeringDNA重组：不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成重新组合的DNA分子的过程，称为DNA重组（DNArecombination）。基因工程的概念：按照既定的目的和方案，把目的基因片段与载体DNA连接形成重组DNA分子，然后将其导入宿主细胞，并对含有目的基因的细胞进行克隆，最后利用克隆的基因表达、制备蛋白质或多肽，或定向改造细胞乃至生物个体。这种技术方法称为基因工程。基因工程的基本过程：目的基因的制备载体的制备目的基因与载体的连接重组DNA分子导入宿主细胞含目的基因细胞的筛选和鉴定第一节工具酶工具酶限制性内切核酸酶DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端脱氧核苷酰转移酶TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶修饰酶一、限制性内切核酸酶（一）概念

限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）是指能识别双链DNA分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶（restrictionenzyme）。（二）限制酶的分类

Ⅰ限制酶：通常在识别位点下游100~1000bp处切割DNA，切割位点难以预测。

Ⅱ限制酶：在识别位点切割DNA，切割位点固定，序列可知。

Ⅲ限制酶：在识别位点附近切割DNA，切割位点难以预测。（三）限制酶的命名命名规则：用来源细菌的英文缩写斜体符号命名。它的第一个字母大写，代表细菌的属名；第二、三字母小写，代表细菌的种名；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。名属种株序来源称名名名号菌株EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliRHindⅢHindⅢHaemophilus

influenzaedHindⅡHindⅡHaemophilus

influenzaedHpaⅠHpa/ⅠHaemophilus

parainfluenzae（三）限制酶的识别和切割位点

特点：

1、通常是由4~6个碱基对组成的具有回纹序列的DNA片段；

5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`

2、大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5`或3`粘性末端；5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`EcoRⅠ5`粘性末端5`---CTGCAG---3`3`---GACGTC---5`5`---CTGCAG---3`3`---GACGTC---5`PstⅠ3`粘性末端

3、部分限制酶沿对称轴切割DNA双链，产生平端。5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`平端SmaⅠ（四）同功异源酶

来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶。5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`BamHⅠ和Pst

Ⅰ的共同识别位点（五）同尾酶有些限制酶识别序列不同，但可产生相同粘性末端，这些酶称为同尾酶。5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`BamHⅠ5`---NGATCN---3`3`---NCTAGN---5`5`---NGATCN---3`3`---NCTAGN---5`Sau

3A二、修饰酶（一）DNA聚合酶Ⅰ

Klenow片段的用途：

1、补齐双链DNA的3`末端；

2、双链DNA3`末端的标记；

3、在cDNA合成中，第二链的合成；

4、DNA序列的分析。（二）逆转录酶主要用于cDNA的合成，构建cDNA文库。（三）T4DNA连接酶（四）碱性磷酸酶（五）末端脱氧核苷酰转移酶（六）TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶第二节载体

vector载体（vector）载体克隆载体表达载体质粒噬菌体粘性质粒M13噬菌体大肠杆菌表载体酵母菌表达载体哺乳动物表达载体一、克隆载体（一）质粒（plasmid）质粒（plasmid）概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独立进行复制的环状DNA分子。质粒的特性（1）寄生性（2）稳定性（3）自主复制性（4）传递性（5）表型效应（6）不相容性（7）重组性（8）可消除性（9）分子量较小组建理想载体的质粒应具备的特点：

1、分子量较小。

2、拷贝数较高。

3、具有可供选择的遗传标记。

4、具有多个限制酶的单一切点（多克隆位点）。

5、具有复制起始点。HindⅢEcoRⅠBamⅠHindⅠMstⅠ多克隆位点Multiplecloningsites常用的克隆质粒载体:

pBR322

pUC系列

pGEM系列pUC18pUC19pBR3224363bpAprTcroriAprLaclZ`pUC18HindⅢEcoRⅠpUC192686bpEcoRISaclKpnlSmal

XmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllacZ`ori0447Amlll806Ppai1765Ctr10i11779Gsul1784Scal2177Xmnl2294Sspl2501Aatll26117EcoO1092674Ndel183Narl235Plac图15-7质粒pUC19396（二）噬菌体噬菌体（bacteriophage）溶菌感染重组感染细菌噬菌溶菌性溶源性体噬菌体衣壳蛋白基因整合和重组基因粘性末端粘性末端调控区插入型载体置换型载体两类噬菌体载体适用于建立cDNA基因文库的噬菌体载体：

gt10

gt11这两种载体属于插入型载体。CI43.3kbgt10LacZ43.7kbgt11（三）粘性质粒

1、构成：由噬菌体的cos区和质粒构成。

2、特点：（1）带有抗药性基因，如Ampr、Tctr（2）带有cos区（3）具有一个或多个限制酶酶切位点。（4）分子量较小，但能容纳较大的DNA片段。（5）粘性质粒较小，体外不能包装，但其重组体可体外包装。（四）M13噬菌体单链DNA

用于序列分析二、表达载体（expressingvector）表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体。表达载体常由克隆载体改造而来。常用表达载体的受体细胞：原核细胞——大肠杆菌、分支杆菌、放线菌等；真核细胞——酵母菌、哺乳动物细胞、人体细胞。（一）大肠杆菌表达载体

大肠杆菌表达载体应有的结构成分：复制起始点抗性基因多克隆位点表达系统元件表达系统元件：PRBS启动子核糖体结合位点MCSTS多克隆位点终止信号1、启动子（promoter）大肠杆菌表达载体中常用的启动子：（1）trp-lac启动子（又称tac启动子）

tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子，由trp启动子、lac操纵子的操纵基因和SD序列融合而成。受lac阻遏蛋白的抑制，异丙基硫代半乳糖苷的诱导表达。（2）噬菌体PL启动子特点：受温度的控制，低温（37C）下被阻遏而抑制，高温（42C）下去阻遏而激活。（3）T7噬菌体启动子

2、核糖体结合位点（ribosome-bindingsite,RBS）

RBS由SD序列、核糖体识别序列和起始密码（ATG）组成。但有时也将SD序列称为核糖体结合位点。ACACUAGG

UCUCCU

AGGAPuPuUUUUPuPuAUG3`5`核糖体小亚基的16SrRNA5`3`mRNA

SD序列核糖体小亚基识别序列起始密码SD：Shine-Dalgarno，人名SD序列：…AGGA…或

…AGGAGG…

3、转录终止序列一般由一段GC富集区组成的反向重复序列，具有回纹结构，转录产物的对应区可行成“发夹”结构。转录终止机制有两种：依赖因子的转录终止不依赖因子的转录终止DNA转录产物RNA因子

RNA聚合酶

RNA聚合酶DNA转录产物RNAUUU……UUU……AAA……AAA……（二）哺乳动物表达载体

哺乳动物表达载体应有的结构成分：

原核细胞克隆载体应有元件真核生物复制起始点选择标记性基因真核表达元件真核表达元件启动子/增强子多克隆位点终止信号加尾信号

1、启动子和增强子原核生物启动子和增强子在哺乳动物细胞内不起作用。真核表达载体必须有真核启动子和增强子。常用的有：（1）病毒源启动子和增强子

SV40病毒早期基因启动子和增强子

Rous肉瘤病毒基因长末端重复顺序。人类巨细胞病毒启动子腺病毒晚期基因启动子（2）真核细胞源启动子和增强子肽链延长因子基因启动子

-肌动蛋白启动子热休克蛋白启动子肌酸激酶启动子金属硫蛋白启动子2、终止信号和加尾信号真核细胞的转录终止终止机制是转录越过修饰点后，在修饰点处切断，随即加入polyA。基因工程中最常使用的加尾信号序列来自于SV40病毒。AAUAAA(GU或U)n转录终止修饰点第三节重组DNA技术的基本过程重组DNA技术的基本过程制备目的基因选择和制备载体目的基因与载体的连接将重组DNA分子导入宿主细胞筛选和鉴定目的基因目的基因的克隆和表达一、目的基因的制备（一）用基因组DNA制备目的基因

1、建立基因组文库

基因组文库的概念：首先用限制酶将基因组DNA切成片段，再把每一DNA片段都与一个载体连接成重组DNA分子。将所有的重组DNA都转移入宿主细胞内并进性扩增，得到分子克隆的混合体。这一混合体称为基因组文库。提取基因组DNA限制酶酶切基因组DNA酶切DNA片段与质粒载体连接转移入大肠杆菌进行克隆2、从基因组文库中获取目的基因从细胞中分离高分子量DNA限制酶消化分离所需要的DNA片段（二）mRNA逆转录生成的cDNA作为目的基因

1、建立cDNA文库

cDNA

文库的概念：首先把细胞中分离出的所有mRNA逆转录成各种cDNA，再把每一cDNA都与一个载体连接成重组DNA分子。将所有的重组DNA都转移入宿主细胞内并进性扩增，得到分子克隆的混合体。这一混合体称为cDNA文库。从细胞中分离出mRNA逆转录生成cDNA与载体连接成重组DNA转移入大肠杆菌进行克隆合成双链DNA逆转录酶T4DNA聚合酶2、从cDNA文库中获取目的基因从细胞中分离重组DNA限制酶消化分离所需要的DNA片段（四）制备用于表达的基因片段

1、直接用限制酶切取从基因组DNA

从基因组文库从cDNA文库

2、PCR体外扩增

3、化学合成二、载体的选择和制备三、目的基因与载体的连接（一）粘性末端连接法5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`EcoRⅠDNA连接酶连接酶限制酶（二）利用人工接头连接限制酶限制酶连接酶（三）加入同聚体尾连接限制酶GGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCC末端转移酶酶GCCCCGGGGCGCCCCGGGGCGGGGCCCCGGGGCCCC限制酶连接酶（四）平端连接限制酶T4连接酶四、重组DNA分子导入宿主细胞常用方法（一）转化（transformation）

概念：转化是指将质粒或其它外源DNA导入原核细胞的过程。（1）CaCl2处理（制备感受态细胞）后转化（2）电穿孔法（电击法）（二）转导（transduction）概念：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程称为转导。噬菌体和粘性质粒体外包装法（三）转染（transfection）概念：外源DNA分子导入真核细胞的过程称为转染。五、目的基因的筛选和鉴定（一）遗传学方法1、筛选转化菌常利用质粒的抗生素抗性基因来筛选。质粒载体（Ampr）+大肠杆菌（含目的基因）转化已转化的大肠杆菌未转化的大肠杆菌在含氨苄青霉素培养基中培养生长被杀死2、筛选带有重组体的克隆（1）插入灭活法AmprTetr目的基因AmprTetr插入灭活四环素抗性基因pBR322BamHⅠ（2）-互补-半乳糖苷酶5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷（X-gal）蓝色物质多克隆位点启动子裂开的N端裂开的N端外源DNA半乳糖苷酶N端编码序列pUC182686bppUC182686bp染色体重组体pUC18细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养pUC18含重组体pUC18的白色菌落蓝色菌落含载体pUC18的蓝色菌落半乳糖苷酶C端编码序列转化转化图15-9利用互补原理筛选重组子pUC18amprampr蓝白斑筛选重组质粒（二）免疫学方法（三）核酸杂交法（四）PCR技术（五）酶切鉴定硝酸纤维膜复制培养溶菌、中和蛋白酶处理漂洗、烘干

1、32P探针

2、放射自显影鉴定克隆（含感兴趣DNA）图15-10原位杂交硝酸纤维膜菌落琼脂培养板PCR鉴定重组质粒第四节真核细胞转染一、真核细胞转染的基本方法（一）磷酸钙共沉淀法（二）电穿孔法（四）脂质体介导基因导入（五）显微注射法（六）CaCl2处理后转染二、转染细胞的筛选（一）tk-细胞突变株筛选转染细胞

HAT选择法tk-细胞tk+质粒转染tk+细胞

HAT培养基

生长（二）筛选转染细胞常用的抗性基因：新霉素抗性基因（neor）,此基因对氨基糖苷抗生素G418有抗药性潮霉素抗性基因氨甲蝶呤抗性基因氨基蝶呤抗性基因霉酚酸抗性基因第五节克隆基因的表达一、克隆基因在大肠杆菌中的表达在大肠杆菌中表达外源基因，主要考虑的要素有：1、目的基因2、载体3、目的基因与载体的连接4、受体菌株和诱导条件二、克隆基因在哺乳动物细胞中的表达三、克隆基因在其它表达系统中的表达（一）昆虫表达系统（二）酵母表达系统真核表达体系如：酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。第九章

DNA序列测定DNAsequencing第一节

Sanger双脱氧链终止法Dideoxychaintermination一、Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧终止法是由Sanger于1977年建立的DNA序列测定方法，也称为引物合成法或酶促合成法。

原理

反应物：（1）待测DNA模板，可以是单链也可以是双链。（2）DNA聚合酶Ⅰ

常用Klenow片段催化特点：①模板为DNA；②原料为dNTP；③存在引物的3`-OH；④遵守碱基配对原则；⑤合成方向5`3`；⑥校读作用。（3）原料——dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。其中一种带32P或35S放射性标记。（4）脱氧核苷酸链延伸的特异性终止剂——2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（2`，3`-dideoxynucleosidetripsphate,ddNTP）NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP）OOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHO-32P-

dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOO35SOOOHOHOHHO-35S-dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）OHHHHOCH2A、G、C或T（5）引物——一段寡核苷酸片段

反应过程：（1）引物的结合引物（其5`-末端带有标记）与模板DNA3`端互补结合；GATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH引物结合部位引物3`5`5`3`（2）模板链互补链的合成在DNA聚合酶Ⅰ（或Klenow片段）的催化下，按碱基配对原则，逐个将dNTP加到引物的3`-OH端，合成模板链的互补链；3`5`GATCCCTGAGTAGTCACCTAGGGACTCATC-OH5`3`（3）脱氧核苷酸链延伸的终止在实验中设4组反应体系，每一体系中加入4种dNTP混合物和一种ddNTP。反应时，ddNTP和dNTP会竞争掺入新生DNA链中，使DNA链延伸终止，并以ddNTP结尾。由于ddNTP比例较低，所以终止位点是随机的。经过适当的温育之后，将会合成不同长度的DNA片段。在含ddATP

的反应管中，DNA片段均以ddATP结尾。同理，含ddGTP

、

ddCTP或ddTTP的反应管中，DNA片段分别以ddGTP、ddCTP或ddTTP结尾。CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`Klenow（4）合成产物的电泳分离将上述4个反应混合物平行加到同一变性聚丙烯酰胺凝胶的4个相邻的泳道上作电泳分离。分辨率可达1bp。（5）放射性自显影。（6）从胶片上，直接读出单链DNA的核苷酸顺序。反应物AGCT模板DNA++++引物++++4种dNTP++++ddNTP

ddATP

ddGTP

ddCTP

ddTTPKlenow++++Buffer、ion++++反应过程及生成物：设4组反应体系，组成如下：CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`A组KlenowAAACTAGGGA3`CTAGGGACTCA3`CTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTGmarkerAA组的电泳结果CTAGGCTAGGGCTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddGTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`G组KlenowGGGCTAGG3`CTAGGG3`CTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTGmarkerGG组的电泳结果GCTAGGGACCTAGGGACTCCTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddCTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`C组KlenowCCCCTAGGGAC3`CTAGGGACTC3`CTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTGmarkerCC组的电泳结果CTAGGGACTCTAGGGACTCATCTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddTTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`T组KlenowTTTCTAGGGACT3`CTAGGGACTCAT3`CTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTGmarkerTT组的电泳结果TTTCCCGGGGAAA45678910111214151617markerTAGC电泳方向GATCCCTGAGTAGTCAC3`5`5`3`CTAGGGACTCATCAGTG二、DNA序列测定的策略（一）末端终止法常用试剂1、载体（1）M13噬菌体载体。用于单链模板的克隆和测序（2）pUC质粒载体。用于双链模板的克隆和测序。2、通用引物（一般含15~30bp）通用引物载体DNA互补序列待测DNA合成新链载体DNA互补序列通用引物合成新链4、放射性标记目前常用的是[35S]-dATP5、DNA聚合酶（1）Klenow片段（2）测序酶（sequenase)

目前用的是测序酶2.0版（3）TaqDNA聚合酶二、大片段DNA序列测定的策略1、随机法（或称鸟枪法）大片段DNA超声波、核酸酶限制酶DNA测序123451223234345片段序列重叠排列2、嵌套缺失法（或互套缺失法）插入片段+载体5`凸出端3`凸出端（1）限制酶切割两种限制酶酶切位点（2）外切核酸酶Ⅲ切割外切核酸酶Ⅲ核酸酶SⅠ（3）克隆T4DNA连接酶（4）测序3、引物延伸法4、限制性片段亚克隆法第二节

Maxam-Gilbert

化学修饰法一、MaxamGilbert化学修饰法的原理化学降解法是由Maxam和Gilbert于1977年建立的DNA测序法。其原理是：（1）放射性同位素标记待测DNA末端（3`端或5`端）。（2）化学试剂裂解标记的DNA分子。GG+AC+TC硫酸二甲酯甲酸肼肼（加盐）鸟嘌呤甲基化脱嘌呤作用嘧啶开环胞嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶GG和AC和TC反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点化学裂解反应体系用4组化学试剂裂解末端标记的DNA分子，其中每一组化学试剂特异地针对一种或一类碱基进行切割，由此产生的4组裂解产物均为不同长度的DNA片段的混合物。每一组反应产物中都有一套带相同标记末端的长短不一的DNA片段。（3）高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解产物（4）放射性自显影，从胶片上直接读出DNA的碱基序列5`-GATCACTACGT-3`标记5`-GATCACTACGT-3`5`-GATCACTACG5`-GG裂解G5`-GATCACTACGT-3`1234567891011GGmarker5`-GATCACTACG5`-GATCACTA5`-GATCA5`-GA5`-GG+A12345678910115`-GATCACTACGT-3`裂解G+AG+AG+AG+AG+AG+Amarker5`-GATCACTACGT5`-GATCACTAC5`-GATCACT5`-GATCAC5`-GATC5`-GATC+T5`-GATCACTACGT-3`裂解1234567891011C+TC+TC+TC+TC+TC+TC+Tmarker5`-GATCACTAC5`-GATCAC5`-GATCC12345678910115`-GATCACTACGT-3`裂解CCCCmarker1234567891011C+TGG+ACGATCACTACGTmarker5`-GATCACTACGT-3`二、MaxamGilbert化学修饰法的特点1、不需酶催化的延伸反应，未经克隆DNA片段可直接测序。2、对于含稀有碱基或G+C含量较高的DNA片段，以及寡核苷酸片段，化学修饰法优于双脱氧末端终止法。3、标记可在5`端，也可在3`端，可同时从两个方向测定同一条DNA，测定结果可以互相参照。DNA测序的其它方法1、PCR测序法2、银染色法3、地高辛、生物素标记测序法全自动激光荧光DNA测序第十章核酸分子杂交技术Nucleicacidhybridization第一节核酸分子杂交技术的基本原理一、核酸分子杂交的概念

核酸分子杂交是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下，按碱基配对原则结合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为探针（即杂交体系中的已知核酸序列）和待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。探针：是指能与核酸分子中特定片段互补结合并带有可检测标记的核酸分子或寡核苷酸片段。探针的主要用途是：（1）从基因文库中筛选特定克隆，获得某一重组体。（2）确定基因组中的同源序列。（3）基因在染色体上的定位。（4）基因诊断（5）法医学中的应用（6）其它核酸分子杂交过程一般需要经历了核酸的变性和复性两个阶段。变性复性、杂交复性、杂交二、核酸的变性与复性（一）DNA的变性（denaturation）1、概念

DNA分子在某些理化因素的作用下，其两条互补链之间的氢键发生断裂，双螺旋结构松开分成两条单链。这一过程，称为DNA变性。DNA变性的常用方法热变性酸碱变性化学试剂变性2、DNA变性的常用方法（1）热变性305070901001.51.41.31.21.10DNA热变性曲线A260ºCTm

增色效应：核酸分子在变性过程中，其溶液的A260会增大，此现象称为增色效应。

融解温度（meltingtemperature,Tm）：

DNA分子热变性程度达到50%时所对应的温度，称为融解温度或解链温度。Tm的影响因素：

①DNA分子的碱基组成Tm与DNA分子碱基组成的关系Tm=(G+C)%0.41+69.3从上述关系可看出，DNA变性解链是一个区域一个区域发生的，AT富集区先解链，GC富集区后解链。因此，DNA变性曲线应是阶梯式的。②溶液的离子强度一般情况下，在低离子强度溶液中，DNA的Tm较低，且解链温度范围较宽；在高离子强度溶液中，Tm较高，解链温度范围较窄。

③

pH

一般情况下，核酸溶液的pH在5~9范围内，DNA的Tm变化不明显；当溶液的pH<4或>11时，DNA的Tm会降低。④变性剂变性剂可降低DNA的Tm（2）酸碱变性核酸溶液pH<3或>10时，核酸分子的双链完全打开。常用碱变性法。（3）化学试剂变性常用的化学试剂有：尿素、甲酰胺、甲醛等。

3、变性DNA分子理化性质的变化：（1）黏度降低（2）密度增加（3）沉降系数增加（4）A260吸光度值增加（5）细菌转化能力消失（二）DNA的复性（renaturation）

1、概念变性DNA的两条互补单链，在适当条件下,重新结合恢复双螺旋结构的过程，称为DNA的复性。2、影响复性或杂交的因素（1）核酸分子的浓度和长度核酸复性反应方程式：

dC/dt=kC2当T=0时，C=C0，则：

C/C0=1/(1+kC0t)当t=t1/2时,C/C0=0.5，则：

C0t1/2=1/k在杂交反应过程中，探针的浓度和长度通常是：浓度：0.1~0.5g

长度：50~300bp（2）温度一般情况下，复性温度=Tm–20ºC~25ºC

寡核苷酸探针杂交反应通常在Tm–5ºC下进行。确定杂交反应温度时应考虑以下几点因素：①Tm每降低1~1.5ºC，错配率增加1%；②RNA-DNA杂交体的稳定性较DNA-DNA杂交体高，Tm应相应增加10~15ºC；③采用RNA探针时，加入适量的甲酰胺，以降低Tm;④寡核苷酸探针的Tm：

Tm=4(G+C)%+2(A+T)%（3）离子强度（4）甲酰胺（5）核酸分子的复杂性（6）非特异性杂交反应常用非特异性位点封闭物：

①变性的非特异性DNA：如鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA

②高分子化合物：如Denhardt溶液，脱脂奶粉第二节核酸分子杂交技术的基本方法Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点和狭缝印迹杂交原位杂交核酸分子杂交技术的基本方法一、Southern印迹杂交

Southern印迹杂交是一种DNA与DNA的分子杂交法。（一）待测DNA样品的制备

1、提取待测DNA2、限制酶消化DNA（二）电泳分离酶切DNA片段常用电泳方法：琼脂糖凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）凝胶中核酸变性

1、碱变性

2、中和处理（四）Southern转膜

1、常用的固相支持物：硝酸纤维素膜，尼龙膜，化学活化膜、滤纸等。2、常用的转膜方法（1）毛细管虹吸印迹法湿滤纸缓冲液滤纸桥凝胶硝酸纤维素膜吸水纸纸玻璃板支持台容器重物（2）电转移印迹法尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+–滤纸电极（3）真空转移法（五）制备探针（六）Southern杂交

1、预杂交

2、杂交（七）杂交结果的检测

1、放射性自显影

2、非放射性标记物显色二、Northern印迹杂交

Northern印迹杂交是一种应用探针检测RNA的分子杂交法。

Northern印迹杂交的基本原理和方法与Southern印迹杂交大致相同。只是在以下几点有所不同。Northern印迹杂交靶核酸RNADNA电泳变性电泳非变性电泳转膜毛细管虹吸毛细管虹吸法转移前法转移前无须中和须中和Southern印迹杂交两种印迹杂交法的不同点三、斑点和狭缝印迹杂交（dotblot）

即将RNA或DNA变性后，直接点到硝酸纤维素膜上，然后与探针进行固-液相杂交。四、原位杂交（insituhybridization）即将细胞涂片或组织切片适当处理后，用探针直接与细胞或组织中的核酸进行杂交。原位杂交的基本方法1、细胞或组织的固定2、组织细胞杂交前的预处理3、制备探针4、杂交5、杂交结果的检测第三节探针的标记一、探针的种类1、cDNA探针2、基因组DNA探针3、寡核苷酸探针4、RNA探针二、标记物（一）核素标记物

32P、35S、3H（二）非核素标记物1、半抗原：生物素、地高辛。2、配体：生物素3、荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明4、化学发光