基于免疫学分析CD4分子在牦牛淋巴器官的表达,畜牧兽医论文

基于免疫学分析CD4分子在牦牛淋巴器官的表达,畜牧兽医论文牦牛〔Bosgrunniens〕是青藏高原土着动物的典型代表之一，素有高原之舟之美誉。青藏高原是世界上平均海拔最高，面积最大的高原，高寒、缺氧及强辐射是高原地区主要应激因子，应对这些生态压力，牦牛机体免疫和健康状况发挥至关重要的作用。流行病学调查表示清楚，牦牛疫病主要为细菌性传染病和寄生虫病，呈散发性发生，治疗后未构成流行〔姬秋梅，2001;姚金桂，2018;殷铭阳等，2020〕。由此可见，牦牛具有较好的抗寒抗病能力，因而对其免疫器官研究具有特殊的意义和价值。但由于牦牛分布地域的限制，现场采样较困难，当前关于牦牛免疫系统尤其是相关免疫活性分子及细胞的研究报道较少〔张倩等，2020;康新华等，2020〕。机体免疫系统主要保卫健康细胞免受下面两个威胁：感染和创伤。T细胞是适应性免疫系统的成员细胞，被激活之后通过诱导级联反响分泌促炎细胞因子和细胞毒性分子和/或通过直接的细胞介导的毒性作用，去除病毒感染细胞、癌细胞和其他病原体。胸腺为机体中枢免疫器官，是培育T淋巴细胞的苗圃〔Pearse,2006〕。脾、淋逢迎及血结属周围淋巴器官，是引起免疫应答的重要场所〔Luscietietal.,1980;王世英等，1992;沈元新，1997;Cesta,2006〕。值得一提的是，血结作为反刍动物免疫系统内的一种独立淋巴器官，其免疫功能常被免疫学家所忽视。研究表示清楚，牦牛血结组织构造与淋逢迎、脾类似〔董曼霭，张爱琴，1989〕，然而，牦牛血结在免疫活动中的作用尚不明确。这提示能够通过比拟牦牛血结与其他免疫器官内的免疫活性分子及细胞的数量与分布，初步探寻求索牦牛血结的免疫功能。哺乳动物的CD4分子是辅助性T淋巴细胞〔Th〕重要的外表标志，其是一种跨膜糖蛋白〔Litt-man,1987〕，广泛介入T细胞受体对主要组织相容性复合物Ⅱ〔majorhistocompatibilitycomplexⅡ，MHCⅡ〕分子递呈抗原的辨别和信号传递〔Leahy,1995〕。CD4+T细胞通过分泌细胞因子和趋化因子激活和〔或〕招募靶细胞，在细胞免疫反响中发挥重要的生物学功能〔Abbasetal.,1996;Romagnani,1996;Zhuetal.,2008〕，主要包括：〔1〕抵御胞内病原微生物感染；〔2〕抵御胞外持续存在的蠕虫、线虫等寄生虫感染；〔3〕介入某些本身免疫病、移植排挤反响、急性及慢性炎症性疾病等免疫病理经过发生、发展〔Parketal.,2005〕。除此之外，CD4+T淋巴细胞在去除癌变组织/细胞经过中也有重要意义〔Wiederetal.,2005;Greenbergetal.,1985;Kamiryoetal.,2018〕；除此之外，CD4+T淋巴细胞具有不依靠CD8+T淋巴细胞的肿瘤杀伤效果〔Perez-Diezetal.,2007〕。因而，以CD4+T淋巴细胞为主的T淋巴细胞亚群分布及数量的基础研究，对于临床各类疾病的诊断、治疗监测、发病机制、药理作用机制等方面至关重要。当前，有关CD4分子在免疫器官的数量及分布研究主要集中在牛〔Bostaurus〕〔Bensaidetal.,1991;Zhangetal.,2020〕、羊〔Ovisaries〕〔Thorpetal.,1991〕、兔〔Oryctolaguscuniculus〕〔Jek-lovaetal.,2007〕、猫〔Feliscatus〕〔Bortnicketal.,1999〕等动物，有关牦牛CD4分子研究未见报道。本研究采用RT-PCR法克隆牦牛CD4的基因序列，通过实时荧光定量PCR、Westernblot及免疫组织化学SABC法检测健康成年牦牛胸腺、脾、肠系膜淋逢迎及血结内CD4mRNA及蛋白的数量及分布，初步了解CD4分子在机体特异性免疫应答的作用机理，为进一步探寻求索牦牛免疫遗传学和免疫生物学等相关研究提供基础资料。1材料与方式方法1.1实验材料采集3岁成年健康雄性牦牛〔Bosgrunniens〕胸腺、脾及分布于空肠的肠系膜淋逢迎和血结，各5头份，取自青海西宁屠宰场。1.2方式方法1.2.1样品采集与准备采集的牦牛胸腺、脾、肠系膜淋逢迎及血结，部分放入4%中性多聚甲醛固定，用于石蜡切片进行免疫组化检测。部分迅速放入液氮中过夜，次日移至-80℃超低温冰箱保存，以备提取组织RNA和蛋白质。1.2.2引物设计与合成根据GenBank登录的黄牛〔Bostaurus,NM_001103225.1〕、绵羊〔Ovisaries,NM_001129902.1〕、山羊〔Caprahircus,EU913093.1〕、白鲸〔Delphinapterusleucas,AF071799〕、海豚〔Tursiopstruncatus,NM_001280654.1〕基因序列，采用PrimerPremier5.0软件，设计牦牛CD4基因测序引物〔yakCD4〕；根据测序所得牦牛CD4〔KP030826〕和牦牛-actin〔DQ838049〕基因序列，用PrimerPremier5.0软件设计实时定量PCR引物，由TaKaRa公司合成〔表1〕，序列分析使用NCBI在线软件、MEGA5和DNA-man软件。1.2.3mRNA提取、反转录cDNA及PCR扩增根据TRIzol〔Invitrogen,美国〕总RNA提取试剂盒讲明书提取各实验组织总RNA.根据反转录试剂盒〔Invitrogen〕讲明将RNA反转录成cDNA.PCR反响体系为20L:模板〔400ng/L〕1L,上下游引物〔0.2mol/mL〕各0.5L,TaqPCRMasterMix10L,无菌去离子水8L.反响结束后取10LPCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳〔150V20min〕检测；凝胶成像系统采集图像。DNA胶回收试剂盒〔Omega〕纯化PCR产物片段，送华大基因测序。1.2.4实时定量PCR检测使用罗氏480实时定量PCR仪进行实时定量PCR检测。实时定量PCR反响体系：10LSYBRPremaxTag〔TaKaRa〕、上、下游引物各0.5L、1LcDNA样品和8L灭菌超纯水。实时定量PCR反响程序：95℃预变性5min;95℃变性10s,62℃分别退火10s,72℃延伸15s,共45个循环；95℃5s,65℃1min,40℃30s.每个循环的退火及延伸阶段采集荧光信号数据。扩增结束后根据溶解曲线报告判定反响的特异性。为保证样品中目的基因相对表示出量的准确性，每管样品设3个重复。采样相对定量分析法分析基因表示出〔Pfaffletal.,2002〕。实验数据用Excel整理后利用SPSS21.0软件进行方差分析，采用Duncan法进行均值的多重比拟。1.2.5组织中CD4蛋白表示出水平的Westernblot检测液氮保存的胸腺、脾、肠系膜淋逢迎及血结等组织，进一步在液氮中研磨后，按1mLRIPA+10L苯甲基磺酰氟〔phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF〕〔100mmol/L〕〔Solarbio〕的比例参加RIPA和PMSF〔先加RIPA再加PMSF〕，匀浆约30min.4℃1200g离心5min,收集上清，调整蛋白浓度，按比例参加4SDS上样缓冲液〔Solarbio〕，沸水煮约10min,使蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为10L,当蛋白跑至分离胶，电压由80V切换为100V直至电泳结束。用300mA的电流在4℃冰箱内电泳1~2h,将蛋白转至PVDF〔Solarbio〕膜。再以5%脱脂牛奶封2h,分别参加一抗小鼠Anti-CD4〔1/200