燃煤pm25不同组分对血管内皮细胞的毒性

等:等:PM25不同组分对血管内皮细胞的毒性燃油复合型但燃煤污染产生的M25污染仍较为严重．国家2009年发布的公报显示中国煤30.2108t20089.2%远远高于欧盟和世界平均水平［2］．燃煤排放的污染物以颗粒物为主其中细颗粒物25贡献较大．山西某煤烟型污染城市大气颗粒物污染源解析研究显示在燃煤土壤建材交通冶金和燃油6种主要污染源中燃煤源对大气颗粒物的平均贡献率最大采暖期和非采暖期燃煤对M25的贡献率分别为35%～48%和20%～42%［3］．受人口化的影响心血管疾病(CVD)是许多国家的主要原因．CVD由许多因素促成包括缺乏锻炼不良饮食和吸烟但现有证据逐渐显示于环境污染物对心脏的健康有着深远的影响．DOCKERY等［4］对哈佛六城市队列研究结果显示空气污染与心血管疾病

M2578Lmin)，METTLERTOLEDO分析天平(梅－托利多仪器公司，AL104IC)，石英纤维采样滤膜(PALL公司)，0.22μm滤器(PALL公司)，超声震荡仪江苏昆山市超声仪器公司舒美KQ500DB)真空冷冻干燥机(亚泰科隆公司，LGJ－18)，生物安全柜(mm司)，CO2恒温培养箱(Themom公司)，倒置显微镜(OLYMPUS公司，TH4－200)，D－1型自动蒸汽灭菌锅(发恩科贸有限公司)Model680型酶标仪(Bio-Rad公司)．1.1. 试DMEM培养液(HyCone公司)，胎牛血清(HyCone公司)，磷酸盐缓冲液PBS(HyCone公司双抗青霉素链霉素华北制药公司)，胰蛋白酶(m公司)，二甲基亚砜相关并提示细颗粒物

2.

污染与心肺疾病的

m公司)，二氯甲烷色谱纯Baker公司)，MTS试剂盒 Promega公司)增加显著相关．POPE 协年均质量浓度每增加(ACS)队列研究结果显示在控制各项混杂因年均质量浓度每增加后

2.

1.2. 燃煤M2以大同散煤为样煤采用 撞击式中流μgm3心血管疾病率将增加8%．可见，PM可能是与CVD有关的主要环境污染物之一．

2.

2.颗粒物采样器78Lmin)90mm的石英纤维滤膜利用固定源稀释通道对燃煤排放细颗粒研究显示，PM25可到达细支气管及肺泡通肺部氧化应激炎症反应释放炎症因子和细胞因子介导心血管部分组分(溶性过渡金属等)甚至可以穿过肺泡间质进入血液循环直接影响心血管系统［68］该研究选择大同散煤为样煤采集细颗粒物以人脐静脉内皮细胞Ahy926为研究对象采用MTS法检测燃煤M25不同组分分别24h后对血管内皮细胞的毒性作用通过比较燃煤M25不同组分对Ahy926细胞的毒性大

物进行直接．采样时将大同散煤块加工到3～5cm用焦炭引火待火焰稳定后将采样通道和燃煤炉连接后将已称量好的煤块均匀地置于炉内同时开泵开始采样直到燃尽记录开始5m时采样流量和结束5m时的采样流量．石英纤维滤膜采样前要在马弗炉中6002h，恒温干燥24h后称重并用灼烧后的铝箔包装采样后用铝箔纸包好并在同样条件下平衡24h，20避光保存小以期为探寻M25对心血管细胞毒性的优势组

12

2.

全颗粒物无机组分和有机分及进一步探讨燃煤M25对心血管毒性机制奠定基础 1. 材1.1. 人脐静脉血管内皮细胞株EA．hy926购自美国ATCC细胞库增殖周期约为31h1.1. 仪

分的提取全颗粒物提取:将载有燃煤25的石英纤维滤膜的采样面朝下置于50mL去离子水中超声振荡30m2次功率500W)以洗脱颗粒物提8层纱布过滤除去石英纤维滤膜碎片将全颗粒物悬液分装到已的小瓶中，5mL瓶真空冷冻干燥成干粉称重后用灭菌PBS配制成1002505001000和2000μgmL的染毒母液， 第2420避光保存备用无机组分提取:超声振荡同1.2.2节将提的全颗粒物悬液用0.22μm针头滤器过滤真空冷冻干燥成干粉称重后用灭菌PBS配制255020保存备用有机组分提取:将载有燃煤M25的石英纤维滤膜置于索氏提取器内在平底烧瓶中以200mL二氯甲烷提取，60水浴中16h所得的抽提液在60旋转蒸发仪中蒸发浓缩2mL，转移至已洗净的试管中氮吹浓缩至干称重后用色谱纯二甲基亚砜DMSO100250500，1000和2000μgmL的染毒母液20避光保存备用．1.2.3血管内皮细胞EAhy926将冻存Ahy926细胞移入含20胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液中375%CO2条件下培养复苏待细胞达80融合时0.25%胰酶消化，1∶3传代用含10%胎牛1双抗的DMEM培养液在375CO2条件下传代培养至对数生长期．2.4细胞染毒和试验分取处于对数生长期的生长良好的细胞用含10%胎牛和1%双抗的DMEM培养液将细胞浓度调整成3105mL1的细胞悬液以每100接种于96孔板在37℃5%CO2条件下培养h将染毒母液超声振15min加入0.5%胎牛DMEM培养液10倍稀释050，

100200μgmL，全颗粒物和无机组分以PBS为溶剂对照有机组分以DMSO为溶剂对照临用前超声15min弃去培养板中原培养液加入已配置好的染毒液每个剂量设置6个平行样．2.5MTS毒性试MTS法检测细胞增殖毒性［10］．细胞染毒结束1h分别加入20μL孔的MTS，96孔板用铝箔纸包好后置于37孵箱内继续1h终止培养用酶联免疫检490nm测吸光度A，参考630nm检测490nm)．试验重复2次后整理分析数据．按下式计算细胞存活率:细胞存活率=A试验组A对照组×1003SPSS17.0软件进行统计处理试验结果以“平均数(x)±标准差(s)表示．多个样本平均数(n)的比较采用单因素方差分析根据方差齐性检验结果方差齐性时选择LSD法方差不齐时选择mneT2法．结1燃煤M25全颗粒物对Ahy926细胞的毒25全颗粒物作用Ahy92624h，随着剂量的增加细胞存活率下降(100～85.36但低剂量组(1025μgmL)和溶剂对照组相比差异无统计学意义50200μgmL剂量组和溶剂对照相比差异均具有统计学意义〔见表1和图1a)．表 燃煤PM2.5不同组分对EAhy926细胞毒性作Table CytotoxicityofthedifferentmpnnofcoalfiredPMonAhy926剂全颗粒无机组有机组(A细胞存活率A细胞存活率A细胞存活率溶剂对1.216±0.100.00±3.1.340±0.100.00±3.1.192±0.100.00±0.1.198±0.98.52±2.1.327±0.05799.00±4.1.142±0.01195.81±0.1.178±0.96.87±4.1.274±0.04495.06±3.1.086±0.00691.08±0.1.116±0.03591.78±2.911.220±0.06091.06±4.470.972±0.02481.57±2.1.086±0.04989.31±4.051.189±0.03888.72±2.840.895±0.00275.04±0.1.038±0.04885.36±3.911.110±0.04982.84±3.640.860±0.01772.18±1.注:数据xs，n6Δ为与溶剂对照组相比P005ΔΔP001*为相同剂量下全颗粒物与有机组分P005＊＊P001．为相同剂量下无机组分与有机组分相比P005P001燃煤M25无机组分对Ahy926细胞的毒燃煤M25无机组分作用于EA．hy926

h，(100～8284各剂量组和溶剂对照组相比差异均具有统计学意义〔见表1和图1b)等:燃煤PM25不同组分对血管内皮细胞的毒性 燃煤M25有机组分对Ahy926细胞的毒燃煤M25有机组分作用于Ahy92624h，随着剂量的增加细胞存活率下降(100～7218各剂量组和溶剂对照组相比，差异均具有统计学意义〔见表1和图1c)1燃煤PM25不同组分EA细胞毒性的剂量反应曲线g1DoseeffectcurveofthedifferentmpnncytotoxicityofcoalfiredPMonAhy9264燃煤M25不同组分对Ahy926细胞毒性全颗粒物无机组分和有机组分对Ahy926细胞活性均具有抑制作用10μgm剂量组细胞存活率分别98.52全颗粒物99.00无机组分9581有机组分其他剂量组细胞存活率均为全颗粒物无机组分有机组分即燃煤M25不同组分对Ahy926细胞毒性具有全无机组分有机组分的趋势但全颗粒物和无机组分对Ahy926细胞的活性抑

制在各剂量组均无统计学差异;而有机组分分别在高剂量组与全颗粒物和无机组分比较具有统计学意义有机组50100200μgmL剂量组对Ahy926细胞毒性明显高于全颗粒物和无机组分但在低剂量组比较无统计学差异见表1和图2注P005和P001为染毒剂量相同时无组分和有机组分相比;*(P005和＊＊P001为染毒剂量相同时全颗粒物与有机组分相比．2燃煤PM25不同组分EAhy926细胞毒性比较Fg2CmpacytotoxicityofthedifferentmpnnofcoalfiredPMonAhy926cells讨论2.2004年POPE等［1］研究显示PM污染导致心血管疾病率的上升中缺血性心脏病心率失常心力衰竭和心脏骤停占主要部分;健康效应机制主要包括肺部炎性反应动脉粥样硬化加速及自主神经功能紊．而动脉粥样硬化(AtherosclerosisAS)是心血管系统疾病中最常见的疾病2.础．现在血管内皮的损伤几乎被公认为是AS发生的始动环节血管内皮损伤血栓形成是许多心血管病的病理基础PM诱导的炎症可以作用于血管内皮细胞导致内皮功能从而加速AS进展可能是颗粒物污染和心血管之间关系的基础［12］．血管内皮细胞VascularEndothelialCell)具有多种生理功能血管内皮损伤是许多心血管疾病的病理基础．人脐静脉内皮细胞被广泛用于内皮功能的研究中根据研究目的的不同可以选择HUVEC原代培养细胞和细胞株．研究显示大气M25可诱导心血管内皮细HUVEC)ROSNO活化及NFκB转录最 第24导致细胞．活性氧介导的氧化应激可能M25HUVEC细胞损伤的重要机制与炎症反应和心血管疾病存在关联1］．张蕴辉等［14］研究表明城区大气中的M25染毒大鼠心血管内皮24h与对照组相比染毒组的心血管内皮细胞总NOS和iNOS显著增加而cNOS显著降低并且随着M25染毒剂量的增加存在剂量反应关系HUVEC原代培养较为耗时且易出现杂细胞的污染2～3代后细胞就开始衰退难以长期维持对于多种来源颗粒物血管内皮细胞毒性比较研究中存在细胞数量和杂细胞干扰

果更为准确2.由于颗粒物是一种复杂的混合物不同来源的颗粒物由于形成条件的不同其化学组成也大不相同．因此其对健康的影响性质和程度除了与颗粒物的大小有关外还与颗粒物的来源及其所吸附的化学物和生物病原体有关．HUVEC急性于细颗粒物水溶性组分可以改变溶质离子通道的表达及内皮通透性且过渡金属钒可引起表达图谱的明显变化即使在分子水平水溶性过渡金属也可以引起血管内皮细胞功能障碍，最终导致内皮细胞衰减和 2］．HIRANO22.的限制还有其他相关研究采用了ECV304细胞

研究显示PM中的

机组分可使大鼠心脏微血管进行了颗粒物的心血管毒性研究［1517］而该株细胞已被证实为癌细胞派生来的上皮样细胞而非血管内皮［1820］，榷Ahy926是人脐静脉内皮细胞和A549融合的细胞株是目前内皮功能体外研究中最为认可目前绝大多数细胞毒性试验均采用MTT法与传统的MTT法相比MTS法更加快速敏感．MTS是一种新合成的四唑类化台物MTT的应用原理相同．MTS被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成为一种有色的甲臜产物其颜色深浅与某些敏感细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度相关．CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssaya是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒性试验中的活细胞数量的检测试剂．该试剂含有一个新型的四〔MTSa〕PhenazineEthosulfate，PES．PES具有增强的化学稳定性这使它可与MTS混合形成稳定的溶液．检测时只需将少量的CellTiter96 OneSolutionReagent直接加入培养板孔的培养基中，孵育1～4h后以酶标仪490nm的吸光度．在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比．MTS被还原后生成的甲瓒产物颜色较深还原产物稳定使测定结果敏感准确;MTS的还原产物甲瓒是水溶性物质可直接测定，无需用溶解2］．可见在对多种样品细胞毒性比较中MTS试剂盒相比传统MTT法具有方法简便及检测状态稳定的特点细胞毒性比较结

内皮细胞氧化导致抗氧化酶〔如血红蛋白氧合酶1HO1硫氧还蛋白过氧化物酶2TRPO，谷胱甘肽S转移P亚基酶GSTP)NADPH脱氢酶等的mRNA水平及热休克蛋白72HSP72明显升高通过改变内皮细胞的功能而与心血管疾病相关．国内也有研究［24］表明PM5中无机有机提取物均可导致细胞形态的变化存活率的下降代谢能力的降低以及氧化损伤情况的加剧并且高浓度有机提取物的细胞毒性大于无机物这与该研究结果一致．但有研究显示并非有机组分毒性最大如ZHAO等［25］研究表明大气M25水溶组分和有机组分于HUVEC，均可观察到细胞存活率随着染毒浓度的增加而下降所采用的染毒剂量与该研究相同但相同剂量组细胞毒性水溶组＞有机组分．还有研究显示，大气M25不同组分作用Ahy926细胞24h后，细胞活性抑制程度为非水溶组分＞全颗粒悬浮＞水溶组分2］．这些不同组分细胞毒性结果比较的差异可能与M25的来源与组分不同有关．相比大气M25燃煤细颗粒物含有的痕量重金属成分AsNiVSeCdPbCr等和有机组分等．美国国家环境保护局(USEPA)曾细颗粒物M25以及富集在其上面的重金属具有最大的性．LINA等［27］也元素周期表中几乎没有什么元素不存在于煤中．大同市采暖期颗粒物中BaP和PAHs等有机组分及金属元素含量均大于非采暖期［2829］且秋季NiCuZnAs，Se，BrPb等在细粒子中富集程度较高它们主要来源于燃煤尘土壤尘和等:燃煤PM25不同组分对血管内皮细胞的毒性 2.工业源［30］．城市采暖期PM中各种无机离子和重金属元素Fe，Zn，CdPb等高度富集显著高于非采暖期说明冬季燃煤对重金属元素贡献明N健康的有害重金属元素高度富集在M25中［31］．研究显示燃煤颗粒物中Fe等金属元素［32］可诱导豚鼠肺泡巨噬细胞产生活性氧自由基［33］引起脂质过氧化损伤从而介导血管内皮损伤．可见燃煤颗粒物成分更为复杂有害元素及成分高度富度但目前燃煤源颗粒物健康效应研究较少其毒性机理尚待探讨．2.结燃煤M25不同组分全颗粒物无机组分、有机组分均对EA．hy926细胞活性抑制作用明显且存在剂量反应关系．相同剂量组比较有机组分的细胞毒性显著高于全颗粒物和无机组分而无机组分和全颗粒物无统计学意义上的差别．燃煤M25引起血管内皮损伤机制仍需进一步研究．参考文献(References［1］张楚莹王书肖赵瑜等．为源颗粒物排放现状与趋势分析J．环境科学，200930718811887［2］国家．中民2009年国民经济社会发展统计公报］．:国家，2010．［3］金银龙何公理刘凡等中国煤烟型大气污染对人群健康危害的定量研究J．卫生研究，2002315342348［4］DOCKERYDW，POPECA3rd，XUX，etaAnassociationbwairpollutionandmoainsixUScities［NEnJMed，1993，329(24):17531759．［5］POPECA3rd，BURNETTRT，THUNMJ，etaLungcancercadopumonamortalityanlongterexposuretofineparticulateairpollution．JAMA，2002，287(9):11321141．［6］BROOKRD，FRANKLINB，CASCIOW，etaApollutionandcardiovasculardisease:asaemenforhealthcareprofessionalsfrotheExpertPanelonPopulationandPreventionScienceoftheAmercaHeaA［J．Circulation，2004，109:26552671［7］NOGUEIRAJB．ApollutionandcardiovascularJ．RevPortCardiol，2009，28(6):71533［8］NEMMARA，HOETPHVANQUCKENBORNB，etPassageofinhaledparticlesintothebloodcirculationinhumanCirculation200，105:411414．

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