分子克隆课件

第二章DNA克隆技术本章，我们讨论4个问题：1.什么是DNA克隆技术——DNA克隆技术的概念。2.为什么能进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的原理和技术路线。3.怎样进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）4.DNA克隆技术的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。DNA重组/基因重组利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。克隆的含义DNA克隆：分子水平细胞克隆：细胞水平克隆羊：无性繁殖个体水平（一）基因（gene）

基因从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（geneticengineering）

基因工程有目的的通过分子克隆技术，人为操作改造基因，改变生物的遗传性状的系列过程，总称为基因工程。

第一节概论一、历史1944肺炎双球菌转化实验证实DNA是遗传物质1953DNA双螺旋模型1960’s遗传密码、中心法则1970反转录酶1946质粒1968-70限制酶1972不同来源的DNA片段体外连接成重组DNA分子1973转化、筛选重组质粒的阳性克隆TheDoubleHelix(1953)ThefoundationofmolecularbiologyFrancisH.CrickJamesD.Watson中心法则基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

基因克隆技术路线切接转筛分常用的工具酶（toolenzymes）有：1.限制性核酸内切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA连接酶（DNAligase,ligase)3.逆转录酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminaltransferase)7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。第二节工具酶一、限制性内切酶定义：特异性识别双链DNA并进行切割的酶。

内切：在DNA内部切割

限制性：识别特异位点切割

GAATTCCTTAAG

EcoRⅠ酶切位点

命名（1973年Smith原则、Ⅱ型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种不同特异性限制酶，按发现顺序排列

如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichiacoli）R株分离得到的第一种限制酶。分类

ⅠⅡⅢDNA底物

双链DNA

双链DNA双链DNA

辅因子

Mg2+ATPSAM

Mg2+Mg2+ATP识别序列特异特异特异切割位点非特定特定特定识别序列前后之中之后25bp~27bp

100-1000bp修饰作用有无有限制酶的识别位点一般特征（4点）：（1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。

（2）它能识别DNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。（3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如：

(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于：①

要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256②

同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。

GGATCCCCTAGGBamHⅠ特点Ⅱ型限制酶：识别4-6个核苷酸识别的核苷酸具有回文结构可以形成平末端、粘末端切口概率

星号活力如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端；

5′－G↓AATTC－3′5′－G-OH

p-AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′3′－CTTAAG－5′PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端：

5′－CTGCA↓G－3′5′－CTGCA-OH

p-G－3′3′－G↑ACGTC－5′3′－GACGTC－5′还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（bluntend）如SmaI:

5′－CCC↓GGG－3′5′－CCCGGG－3′3′－GGG↑CCC－5′3′－GGGCCC－5′Ⅱ型限制酶切口特点1．异源同工酶（Isoschizomers）也称同裂酶:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：(1)识别顺序与切割方式同，如：MboⅠ和SauSⅠ（－NN↓GATCNN-3′）-NNCTAG↓NN-5′(2)识别顺序同，切割位点不同，如：SmaⅠCCC↓GGG和XmaⅠ

C↓CCGGG(3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（甲基化*），另一酶不能。如：HpaⅡ→CCGG和MspⅠ→CCG*G

MboⅠ→GATC和Sau3A→GA*TC

几种特殊的内切酶二．DNA连接酶

1.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码

粘末端连接

NAD+供能2.T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码

粘末端、平末端连接已知唯一平末端连接酶

ATP供能DNA连接酶是基因工程重要的工具酶，常用T4DNAligase.（一）功能：催化有互补顺序的两个DNA分子的粘性末端或平头末端3’－OH、5’－P连接作用。（二）来源－噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：

需要ATP、Mg2+作辅助因子；对粘性末端催化活性大于平头末端5′－G↓AATTC－3′5′－G－OH

p-AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′3′－CTTAA-p

OH-G－55′－G－OH。。。p-AATTC－3′3′－CTTAA-p。。。OH-G－5T4DNAligase

DNA连接酶在限制片断的末端连接作用

分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。

分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。分子内连接分子间连接三、聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段T4噬菌体DNA聚合酶TaqDNA聚合酶反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）AMVMLV（1）5′→3′DNA聚合酶活性（2）3′→5′外切酶活性（3）5′→3′外切酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）酶用途：酶活性：（1）cDNA第二条链的合成（2）3’凹陷粘末端的标记，平端化（3）缺口平移法标记DNA探针5’3’DNA聚合酶活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ3’5’外切活性5’3’外切活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶

基因工程很多情况下，E.coliDNApolⅠ可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。

酶活性：1.5′→3′DNA聚合酶，2.3′→5′外切酶活性。酶用途：(1)补平3’凹陷粘性末端(2)同（1），填平过程中，用32PdNTP标记DNA片段3’末端。(3)cDNA克隆中，用于合成cDNA的第二条链。(4)在Sanger双脱氧法ddNTP系统进行序列分析。1.来源

源于T4噬菌体感染的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ聚合活性（2）3ˊ→5ˊ外切酶活性3.基因工程中用途与Klenow片段一致（标记末端，填平5’末端），不同的是可对3’突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，产生3’凹端。T4噬菌体DNA聚合酶（T4DNApol）反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）催化以RNA为模板反转录生成DNA。最初禽类成髓细胞中分离。主要用于反转录mRNA生成cDNA。RNA指导的DNA合成反应；RNA的水解反应；DNA指导的DNA合成反应。AMV：42℃MLV：37℃①分类②作用③活性反转录酶反转录酶还具有RNaseH活性碱性磷酸酶酶活性：催化核酸的5’端脱磷酸反应酶用途:5’末端标记和防止载体自身连接基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

目的基因与载体

Ⅷ因子两端正好有两个酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ，切割后得到1500bp的片段。一、目的基因的获取方法1、染色体DNA的限制性内切酶酶切片段2、通过mRNA反转录合成cDNA逆转录酶AAAA

TTTTAAAA

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌3、从基因组DNA文库获取目的基因mRNA

cDNA

双链cDNA

重组DNA分子

cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制4、从cDNA文库获取目的基因8、最常用的方法：索取5、PCR扩增目的基因6、人工体外合成基因片段7、根据蛋白质序列推导基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

二、载体能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。特性：1复制起点

2多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点3筛选标志Amp+Kan+Neo+4分子量不宜过大否则易断裂、转化效率低5表达载体:还要有P、E、前导序列、加尾信号、信号肽、核定位序列等

载体的分类分类依据类别克隆扩增或表达举例1.按功能分成（1）克隆载体（2）表达载体√√PBR322PCDN32.按进入受体细胞类型分（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE3.按载体来源分质粒载体噬菌体载体病毒载体pGEX-4TM13pAdV54.按克隆片段得大小（克隆能力）分(1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC

质粒（plasmid）

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对，一般3－10kb。常有1-3个抗药性基因，以利于筛选。在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息，如抗药性。具有自主复制的能力，但不能独立存活。接受的DNA大小有限，小于15kb.存在于细菌细胞质中

双链环状DNA分子

大约3～10Kb

具有自主复制和转录能力

不能独立存活

在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息

特性<15kb

一般3～10Kb左右

接受的DNA片段长度主要用于外源基因的克隆和保存，是一种比较原始的克隆载体。pBR322：B,bacteria;R,Resistance.pBR3223、常用质粒pBR3224361bp

TetrAmprpUC18/19

2686bpAmprLacZpGEM-3Z

2743bpAmpr

LacZpUC118/1193162bpAmprLacZ噬菌体（bacteriophage）特点：约50kb，容纳18～22kb片段线性双链，天然粘性末端感染宿主细胞能力强容易筛选、贮存M13克隆载体分子结构图

线形双链DNA分子50kb左右

两端12碱基互补的单链，天然黏性末端。1、特性λ噬菌体可接纳较长片段：18～22kb壳蛋白包装，具有感染宿主细胞的能力，片段为载体的70～105％（15～25kb）均可成熟。易筛选，易贮存。

2、接受的DNA片段长度腺病毒载体（adenovirus，AV）腺相关病毒载体（adenoassociatedvirus，AAV）反转录病毒载体（retrovirus，RV）往往用于真核表达切限制酶的选择

载体上有单一位点目的基因两端存在目的基因剪切后不超过2~3kb粘性末端：连接效率高平末端：难于连接，效率低粘改平：5’凹端削平，

3’凹端补齐削平

接头(linker)

平改粘：

衔接子(adaptor)

同聚物加尾法

3’端突出只能切平是因为DNApol合成需要引物（加在3’－OH末端）且只能按5’－3’方向。

粘改平平改粘：加人工接头人工接头（linker）是指人工合成的，连接目的基因两端的含有某些限制酶位点的寡核苷酸片段，如含EcoRⅠ的接头与目的基因的连接。DNA接头连接法加衔接子

平末端的另一种处理方式是利用衔接子（adaptor）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10-20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

衔接物连接法酶切注意事项酶的保存：低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，避免反复冻融。酶切反应体系：酶量不能超过反应体积的1/10。新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供DNA样品要求：一定纯度和浓度，不能混有酚,氯仿,EDTA,SDS,过多盐类等温度和时间：37℃1-2h反应终止：EDTASDS加热

电泳鉴定酶切是否完全（一）、目的基因、载体平端-平端连接

没有合适的产生粘端的限制酶切位点，可采用平端连接，但连接效率<粘端。并且连接反应中更偏向于载体自身环化。产生：酶切补齐法削平法优点：解决无法解决的问题缺点：载体自身环化双向插入多拷贝插入效率低，酶用量高措施：增加目的基因DNA分子量，增加与载体碰撞的机会。CIP去除载体两端5’—P基团，防止环化。接（二）粘性末端连接

1.利用相同的酶切位点——单酶单切点

用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。优点：二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火，在ligase作用下生成DNA分子重组体。问题与解决办法：自身环化

粘性末端自发形成双链，连接产物含大量的目的基因和载体自身环化的假重组体。

解决办法是

用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和碱性磷酸酶处理载体，去除5‘－P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。

2.利用相同的酶切位点—双酶双切点（定向克隆）优点（1）避免载体/目的基因的自身环化；（2）可控制外源基因插入方向。（3）单拷贝插入。（4）提高连接效率构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。如：目的基因和载体都有EcoRⅠ，PstⅠ酶切位点，产生各自互补粘端，分别配对连接。Pst1Pst1Pst1Pst1酶切鉴定DNA片段的插入方向转转化(transformation)转染(transfection)转化作用(transformation)：质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌并得到表达的过程。

转染(transfection)：重组噬菌体或病毒导入宿主细胞的过程。一、宿主细胞原核：大肠杆菌（DH5α、JM系列、HB101、SSD）真核：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞要求：

1对重组子的复制和扩增没有严格的限制2不存在特异的限制酶体系降解重组DNA3在重组子扩增过程中，不对重组DNA进行修饰4不会产生重组DNA的体内重组5容易导入重组子6符合“重组DNA操作规则”的安全标准二、转化的原理和过程1对数期细菌置于冷Cacl2、Mgcl2中，感受态2加入重组质粒，冰浴30分钟，不要震荡342℃水浴60~90S，热休克4马上冰浴1%的转化效率原理：

细菌在低温和低渗环境，通透性增加，膨胀成球形，此时转化混合物中的DNA形成羟基－钙磷酸混合物黏附于细胞表面，经短暂热休克，促进细胞吸收重组子。筛抗药性筛选插入失活蓝白斑筛选杂交筛选PCR筛选酶切鉴定测序抗生素平板筛选感受态细菌连接混合物42℃0℃转化Amp＋未转化Amp－平板培养筛选Amp＋Tet－阳性Amp＋Tet＋假阳性ABCD假阳性重组子阳性转化菌载体自身环化非目的基因插入载体酶切不完全未转化菌阳性克隆LB＋琼脂糖＋Amp阴性0℃酶切鉴定DNA片段的插入方向正反MPst1Pst1Pst1Pst1oriori测序准确，但成本高。阳性阴性重组DNA技术操作过程可形象归纳为:分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体菌

筛筛选重组体重组DNA技术操作的主要步骤载体目的基因（外源基因）酶切开环载体DNA目的基因连接转化筛选回收培养实验技术质粒的提取及纯化煮沸法碱裂解法SDS法原理：强碱性环境、SDS

细菌染色体DNA变性质粒仍呈天然状态中性高盐

离心蛋白变性沉淀沉淀：染色体DNA、蛋白质上清：质粒DNA片段和载体的制备酶切体系DNA样品1μlEcoRⅠ1μl10×bf1μl水7μl10μl活力单位(IU):一般5IU/μl取1μl的酶可以消化5μM的DNA限制酶切割限制酶的选择

载体上有单一位点目的基因两端存在酶切位点目的基因剪切后不超过2~3kb常用：T4DNA连接酶反应体系：目的基因(300bp,200ng/μl)5μl载体(3000bp,1μg/μl)1μl酶1.5μl10×bf1.5μl水6μl15μl16℃24-48h目的基因与载体片段数之比为5:1或10:1DNA分子的连接（一）氯化钙法1、原理：

细菌在低温和低渗环境，通透性增加，膨胀成球形，此时转化混合物中的DNA形成羟基－钙磷酸混合物黏附于细胞表面，经短暂热休克，促进细胞吸收重组子。转化的原理和过程注意事项：（1）CaCl2

:甘油体积比为(4:1)。（2）重悬细菌沉淀物时切忌剧烈震荡。（3）感受态应该在-70℃保存，近期使用可以保存在-20℃。（4）制备感受态应该用对数期菌(OD6000.2-0.4)。(5)枪头和EP管需要新的高压灭菌。（6）为避免杂菌污染，操作应在超净工作台进行。（二）电穿孔法1、原理：

对数生长中期细菌，冷却离心，用低盐缓冲液充分洗涤，降低细胞悬液的离子强度，用10％甘油重悬细胞，使其浓度为3×1010个/ml，即可用于电穿孔法转化。0～4℃操作，室温转化效率低。2、特点：

优点：细菌制备较氯化钙法容易转化效率较高缺点：需要特殊仪器条件不易掌握细胞杀伤率高（三）转染试剂法

1、阳离子型脂质体

1）转染试剂：

单价：lipofectin、lipofectACTTM

多价：dosper、infectAmineTM等2）特点：转化效率高细胞毒性低转化细胞类型广操作简单易行价格昂贵（四）显微注射

DNA准确注入细胞最可靠的方法。借助电脑更为精确。特点：昂贵每次注射细胞数量有限DNA电泳1、定义：带电物质在电场中的泳动。2、影响因素：样品物理性状电荷：越多，泳动越快。分子大小：越大，泳动越慢结构：越规则，泳动越快DNAPI＝4，pH=8—＋DNA电场强度：

同样的分子电压越大，泳动越快，但过快易拖尾，一般5v/cm。离子强度（缓冲液）TAE（Tris.乙酸.EDTA）：缓冲能力差，成本低，最常用。TBE（Tris.硼酸.EDTA）：缓冲能力最好，成本高，关键实验用TPE（Tris.磷酸.EDTA）：一般不用。支持物介质：琼脂糖（孔径大，可分离100bp-60kp的片段）

PAGE（孔径小，分离5bp-500bp的片段）3、指示剂溴酚蓝：蓝紫色二甲苯青蓝：海蓝色在1％琼脂糖凝胶中相当于500bp的DNA片段泳动的距离在1％琼脂糖凝胶中相当于2000bp的DNA片段泳动的距离500bp2000bp1%琼脂糖凝胶甘油／蔗糖4、染色剂溴化乙锭（EB）：特染DNA，插入两个碱基之间，紫外线下发出红色的光，具有强致癌性。加入方式：直接加入到胶中（1％琼脂糖）称1g琼脂糖粉＋100mlTAE（一定与缓冲液一致）10