酶工程制药.课件

酶工程制药主讲：xxxx酶的根底知识酶的解释：酶是由生物体产生的具有催化剂活性的蛋白质。酶催化特性：高效率 比非催化高108－1020倍 比非酶催化高107－1013倍高度专一性反响条件温和酶催化是可调控的酶工程酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反响器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。酶工程的应用范围〔1〕对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；〔2〕自然酶的别离纯化及鉴定技术；〔3〕酶的固定化技术〔酶和细胞固定化〕；〔4〕酶反响器的研制和应用；〔5〕与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以表达。

微生物酶的开发应用微生物来开发酶的优点：(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产酶产品，生产能力〔发酵〕几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。(3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质根底。(4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在地酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。酶工程酶工程是酶学和工程学相互渗透结合开展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶工程主要包括内容酶的大量生产和别离纯化及它们在细胞外的应用酶的固定化技术和固定化酶反响器基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究抗体酶、核酸酶的研究模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究有机介质中酶的反响,新颖酶的发现、研究和应用酶的来源1〕直接从动植物获得，即从生物体中别离和提纯缺乏：生产周期长，来源有限，还要受一些自然条件的限制。2〕化学合成方法缺乏：一般只适用于短肽的生产，实际应用还需相当长的时间。酶的来源3〕工业微生物发酵，即通过液体深层发酵或固态发酵，是工业上酶的主要来源。其优点如下：微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全微生物繁殖快，生产周期短微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶的菌株。微生物细胞产生酶的分类〔按生成条件〕结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达。诱导酶：参加相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是该酶所催化反响的底物或产物。野生型微生物经过遗传改造后变为高产酶菌株的方法：物理诱变育种化学诱变育种基因工程构建酶的生产优良菌种的条件繁殖快、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最好能产生分泌到胞外的酶，产生的酶容易别离纯化。菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易受噬菌体的感染侵袭易于培养，能够利用廉价的原料进行酶的生产，并且发酵周期短。菌种不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，不产生有毒物质和其他生理活性物质。不产或尽量少产蛋白酶。酶的生产生产菌的来源a、菌种保藏机构和有关研究部门获得；b、大量要从自然界中别离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。筛选产酶菌的方法：采集、菌种的别离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。菌种改进的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。目前常用的产酶微生物及所产生的酶酶在医药领域的应用1、在疾病诊断方面的应用

葡萄糖氧化酶

----葡萄糖酸和过氧化氢----过氧化氢酶---水和原子氧-----无色的化合物氧化成有色的化合物

2、在疾病治疗方面的应用

溶菌酶--分解病原菌的细胞壁--抗菌和消炎作用；尿激酶；SOD

3、在药物生产方面的应用：青霉素酰化酶4、在分析检测方面的应用：多酚氧化酶传感器酶和细胞固定化自由酶酶直接参加至溶液中，酶自身的空间结构不发生改变，保持自己的生物特性。优点：酶解效率高、使用比较方便，特别是在大批量样品处理时。缺点：不能重复使用、自身酶解、寿命短酶和细胞固定化固定化酶的制备固定化酶：指限制或固定于特定间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。〔细胞固定化、固定化细胞〕水溶性酶水不溶性载体固定化技术固定化酶（水不溶性酶）酶和细胞固定化固定化酶的优点具有生物催化剂及固相催化剂的功能。〔1〕可以屡次使用，酶的稳定性提高；〔2〕反响后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化；〔3〕反响条件易于控制，可实现转化反响的连续化和自动控制；〔4〕酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；〔5〕比水溶性酶更适合于多酶反响。酶和细胞固定化固定化酶的缺点：(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的本钱，使工厂开始投资大。(2)比较适应水溶性底物和小分子底物。(3)与完整细胞比较，不适于多酶反响，特别是需要辅因子的反响，同时对胞内酶需经别离后才能固定化。酶和细胞固定化定义:通过载体等将酶限制或固定于特定的空间位置，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。固定化方法：1.载体结合法2.交联法3.包埋法4.选择性热变性法酶和细胞固定化方法〔1〕载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。酶和细胞固定化方法〔1〕载体结合法B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。酶和细胞固定化方法〔1〕载体结合法C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体外表反响基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反响条件苛刻，操作复杂，反响条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。酶和细胞固定化方法〔2〕交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。分为：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。酶和细胞固定化方法〔3〕包埋法：A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反响条件要求高，制备本钱也高。酶和细胞固定化方法〔4〕选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。酶和细胞固定化方法总结⑴载体结合法①物理吸附法②离子结合法③共价结合法⑵载体结合法⑶包埋法①网格型②微囊型⑷选择性热变性法酶和细胞的固定化载体〔1〕吸附载体：无机物和有机物，见P224表6-1。〔2〕包埋载体：卡拉胶、海藻胶〔3〕共价结合载体：纤维素、琼脂、琼脂糖。载体应具备的条件：〔1〕固定化过程中不引起酶变性；〔2〕对酸碱有一定的耐受性；〔3〕有一定的机械强度；〔4〕有一定的亲水性和稳定性；〔5〕有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；〔6〕共价结合时有可活化基团；〔7〕有耐受酶和微生物细胞的能力：〔8〕廉价易得。固定化酶的制备技术

1〕吸附法制备技术：将酶的水溶液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。2〕包埋法制备技术：凝胶包埋：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点以下的温度，然后假设预保稳的酶液，混合均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成固定化酶。固定化酶的制备技术

微囊化包埋：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透膜厚约20nm，膜孔径40nm,其外表积与体积比很大，包埋酶量也多。3〕交联法制备技术：向酶液中参加多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内或酶分子间彼此连接成网格人结构而形成固定化酶。反响速度与酶的浓度、试剂的浓度、PH、离子强度、温度和反响时间有关。固定化细胞的制备⒈固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。固定化细胞的制备

⒉固定化细胞的特点：有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。固定化细胞的优点：①无须进行酶的别离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高③比固定化酶稳定性高④细胞内酶附助因子可再生⑤细胞本身含多酶体系⑥抗污染能力强固定化细胞的制备

固定化细胞的缺点：(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否那么，将影响产品纯度。(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。固定化细胞的制备

⒊固定化细胞的制备技术⑴载体结合法

是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的固定化方法。

载体：主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。

优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。缺点：吸附容量小结合强度低。⑵包埋法将细胞定位于凝胶网格内的技术。与包埋酶法相同。固定化细胞的制备

⑶交联法

用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。交联剂戊二醛等对细胞有毒性，很少用。⑷无载体法

靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。固定化方法的选择⑴固定化酶应用的平安性：按照药物和食品检验标准检查。试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。⑵固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。⑶固定化的本钱：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。固定化载体的选择

最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体。固定化酶的形状⑴颗粒状固定化酶：方法简单，比外表积大，转化效率高，适用各种反响器。如酵母酶铢。⑵纤维状固定化酶：比外表积大，转化效率高，但只适用于填充床反响器。⑶膜状固定化酶：通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。酶膜比外表积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。⑷管状固定化酶：酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反响器，也可组装成列管式反响器。固定化酶的性质〔1〕酶活力的变化：活力大都下降。主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。〔2〕酶稳定性的变化：对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。稳定性提高，有效寿命延长。A、操作稳定性：能否实际应用的关键因素，半衰期到达1个月以上时，即具有工业应用价值。B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存。C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反响温度和反响速度，提高效率。D、对蛋白酶的稳定性：蛋白酶的耐受力有所提高。原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。固定化酶的性质〔3