仪器分析笔记《高效液相色谱分析》

本文格式为Word版，下载可任意编辑——仪器分析笔记《高效液相色谱分析》其次章高效液相色谱分析

§2.1高效液相色谱法概述（把握）

2.1.1高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较

2、与气相色谱法比较

3、高效液相色谱法的发展

A、固定相的变化

填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。目前，出现使用1.0μm填料的超高压液相色谱。

B、滚动相变化

目前，出现120～220℃超热水为滚动相、FID和FPD检测器的HPLC。C、全新方法

剪切流路液相色谱；不同分开机制组合的多维液相色谱以及HPLC与MS、NMR、IR联用的多维液相色谱法。

4、高效液相色谱法的特点

①高压：采用高压输液设备，（150~350）×105Pa②高速：分析速度快；③高效：柱效很高。（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分开；

—9—11

④高灵敏度：10g（UV）；10g（荧光检测）。5、高效液相色谱法的局限

①溶剂用量太大；

②缺乏诸如气相色谱使用的TCD、FID通用型检测器；③不能替代气相色谱法，难分开化合物(柱效10万以上)，必需使用毛细管气相色谱法进行分开；④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa～1MPa压力。

§2.2影响色谱峰扩展及色谱分开的因素（了解）

2.2.1影响色谱峰的扩展的因素

高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于

滚动相的不同。现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分开的影响探讨如下：

高效液相色谱的范氏方程：

22?Csd2CdDm?CmdpCsmdpfH?2?dp????u?u??D?uDDms??m若将上式简化，可写作：

BH?A??Cu

u这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，

影响柱效的主要因素是传质项。1、涡流扩散项He

He?2?dp

式中——?：填充不规则因子；dp：填料平均直径。

?它与载体流速无关；?若柱子填充均匀，填料的颗粒也均匀，则??0?He?0?柱效高；若填充不均匀，?↗?He↗?柱效低。2、纵向扩散项HdCdDmu式中——Cd：常数；Dm：扩散系数；u：滚动项的线速度。

Hd??由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4~5个数量级，因此在液相色谱中，当滚动相线速度大于0.5cm?s?1时，这个纵向扩散项对色谱峰扩展的影响实际上是可以忽略的，而气相色谱法中这一项却是重要的。3、传质阻力项（1）固定相传质阻力项Hs

Hs?Csd2fDsu

式中——Cs：与k（容量因子）有关的系数；df：固定液厚度；Ds：扩散系数。?固定相引起峰扩展解决方法：①液液分派色谱：使用薄的固定相；②吸附、排阻和离子交换色谱：使用小颗粒填料。（2）滚动相传质阻力项①滚动的滚动相中的传质阻力项Hm

Dm式中——Cm：常数（与k有关，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构）；

Dm：滚动相中扩散系数；dp：为填充物的平均直径。

②滞留的滚动相中的传质阻力项Hsm

?原因：多孔固定相造成的部分滚动相滞留。

2CsmdpHsm??u

Dm式中——Csm：常数（与颗粒微孔中被滚动相所占据部分的分数及容量因子有关）。?固定相的粒度?0?其微孔孔径???传质途径?0?传质效率???柱效???。2.2.2液相色谱的H?u曲线

1、液相色谱与气相色谱H?u曲线的区别

Hm?2Cmdp?u

①HPLC板高H比GC小一个数量级，说明HPLC柱效高；②对于HPLC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。2、降低H，提高柱效的方法

①减小填料粒度；②减小填料孔穴深度；

③用低粘度溶剂作滚动相；

④采用低速滚动相（寻常：u?1mL?min?1）。

§2.3高效液相色谱法的主要类型及其分开原理（理解）

根据固定相和分开机理的不同，液相色谱法可分为：1、液液分派色谱法（LLC）2、液固吸附色谱法（LSC）3、离子对色谱法（IPC）

4、离子交换色谱法（IEC）5、离子色谱法（IC）

6、空间排阻色谱法（SEC）

2.3.1液—液分派色谱及化学键合相色谱

1、液—液分派色谱——基于组分在两相间的分派容量因子k的差异而实现分开的。A、固定相：载体+固定液全多孔型担体β，β'-氧二丙腈表面多孔型担体聚乙二醇

异三十烷（角鲨烷）B、载体：硅胶；C、分类：

根据固定液和滚动相（溶剂）的极性不同，可分为正相液液分派色谱和反相液液分派色谱。?为了避免固定相流失，固定相和滚动相极性要相差大。（与GC不同，GC：极性相像相溶）?分析对象与固定液极性一致；?正相色谱：固定液为极性，滚动相为非极性（固定液极性＞滚动相极性）；?反相色谱：（应用最普及）H2O、甲醇等使用便利；价格低廉?固定液为非极性，滚动相为极性；?由于液—液分派色谱固定相易流失，现已被化学键合相色谱所替代。D、原理：

由于试样组分在固定相和滚动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分派。当达到平衡时，物质的分派同样听从下式：

CVK?s?km

CmVs式中——K：分派系数；k：容量因子；Cs：溶质在固定相中的浓度；Cm：溶质在滚动相中

的浓度；Vm：滚动相体积；VS：固定相体积。?分开的顺序决定于分派系数的大小，分派系数大的组分保存值大，后出峰；?液相色谱法中，滚动相的种类对分派系数有着较大的影响。E、应用：液—液色谱能分开多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。

2、化学键合固定相色谱

通过化学反应将有机基团键合到硅胶（载体）表面上，代替机械涂渍的液体固定相。这种固定相避免了固定相流失，大大改善了固定相功能，适用于梯度洗脱，分开选择性大大增加。?化学键合相色谱的出现，是HPLC的重大突破；?化学键合色谱是HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三；?它适用于分开几乎所有类型的化合物。2.3.2液—固吸附色谱法——滚动相：液体，固定相：吸附剂1、原理：基于组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而分开的。

『组分分子结构与吸附剂几何结构相适应时，易于吸附。』2、固体吸附剂主要类型：①极性的硅胶（应用最广）；②氧化铝；③分子筛；

④非极性的活性炭。3、应用：

①分开几何异构体；

②分开含极性基团一致但数目不同的试样，但不能用于分开同系物；③分开具有中等分子量的非极性或极性的、非离子型的油溶性样品。4、缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象

2.3.3离子对色谱法

分开强极性的有机酸、碱存在的问题：

?用正相色谱：保存值太大、峰拖尾，甚至不出峰离子对色谱法?用反相色谱：保存太小

1、定义：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对电子或反电子）参与到滚动相或

固定相中，使其于溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保存行为。

2、分开机理

离子对色谱的分开机理有不同的假说，现以离子对分派机理说明：

在色谱分开过程中，滚动相待分开的有机离子X+（也可以是带负电荷的离子）与固定相或滚动相中带相反电荷的对离子Y—结合，形成离子对化合物X+Y—，然后在两相中分派：

KXY???????X?Y有机相X水相?Y水相?????由于离子对疏水性质不同，导致各组分保存时间不同；?离子对试剂：分析碱→烷基磺酸钠；分析酸→四丁基季胺盐。2.3.4离子交换色谱法1、固定相：离子交换树脂

滚动相：水缓冲溶液；甲醇；乙醇+水缓冲溶液

2、原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子

半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保存时间长；

阳离子交换：R—SO3H+M+＝R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X—＝R—NR4X+OH—3、适合于分析：

①在溶液中能形成离子的组分

②有机物和生物物质，如：蛋白质、氨基酸、核酸等的分开。

2.3.5离子色谱法

离子色谱以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象，近30年有了迅速发展。1、离子交换色谱存在问题：

用电导检测器检测，滚动相是强电解质，强背景完全掩盖待测离子信号。2、抑制柱：使高背景电导的滚动相转变为低背景的滚动相。?1975年Small提出在离子交换柱后，再串结一根抑制柱。?抑制柱装填与分开柱电荷完全相反的离子交换树脂。如：分析阴离子样品Br—，NaOH为滚动相；抑制柱为R—H+；

通过抑制柱后：

NaOH+R—H+→H2O+R—NaNaBr+R—H+→HBr+R—Na

?由于H+淌度为Na+的7倍，提高了检测的灵敏度；?IC还可以分析氨基酸、糖类及有机阳离子；

?由于抑制柱要定期再生，现代IC中，多采用在离子交换柱后接抑制器来实现以上目的。3、阴离子分析例如：

七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分开各组分含量：3～50ppm；

?

②滚动相中溶剂被蒸发，留下溶质；③激光束照在溶质颗粒上产生散射光；④散射光信号→电信号。特点和应用：

?属通用型检测器。

?适合于无紫外吸收、无电活性和无荧光发射样品的检测。?优于IR：信噪比高，可梯度洗提

表2-6-1HPLC中常见检测器的基本特性

§2.7高效液相色谱分开类型的选择（了解）

2.7.1色谱分开类型的选择1、根据相对分子质量选择

?200以下→气相色谱法

?200~2000→液固吸附、液-液分派和离子交换色谱法。?高于2000→凝胶色谱法2、根据溶解度选择

?水溶性样品→离子交换和液液分派色谱法；?微溶于水、易电离样品→用离子交换色谱法；?油溶性或相对非极性样品→液-固色谱法。3、根据化学结构选择

?异构体的分开→液-固色谱法；

?同系物和具有不同官能团化合物→液－液分派色谱；?生物大分子或高分子聚合物→凝胶色谱法；

?离子基团和能电离基团组分→离子交换色谱。

表2-7-1液相色谱分开类型选择参考表

§2.8高效液相色谱应用实例（了解）

2.8.1高效液相色谱应用领域与分析对象举例

§2.9液相制备色谱（了解）

?有机繁杂样品的组成、结构分析时常需要纯化?制备色谱成为最有力的手段?制备色谱：以色谱技术来分开、制备较大量的纯组分2.9.1液相制备色谱的特点与优势1、与分析色谱的区别：?柱容量大

?有组分收集器

2、用HPLC制备的优势：?分开条件温柔?一般不破坏试样?有利于试样收集

2.9.2液相色谱制备的几个主要问题

1、色谱柱容量——制备柱比与分析型柱柱容量要大。?分析型柱：内径：4.6mm

?制备柱：内径：10mm，20mm，50mm…?一次可以制备0.1~1mg纯品?制备色谱主要限制之一：进样量???柱效?0?分开度?0；2、液相制备色谱方法：在分析型HPLC试验，优化，试出最大允许量。3、液相制备色谱仪

?检测器后增加自动馏分收集器；

?可将试样组分按顺序收集在玻璃管内。

§2.10毛细管电泳（CE）（了解）

2.10.1毛细管电泳的基本原理与仪器装置1、基本原理

?电泳：在电场作用下，带电粒子在介质中定向移动。

?毛细管电泳：利用被分析离子在电场作用下移动速率不同而达到分开目的。?CE分析对象：在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。?它有多种分开模式

?可以分开离子和中性分子

?可以采用HPLC中的各种检测方法（1）经典电泳的局限性?电场强度低：

?离子迁移速度慢，分开时间长，组分扩散严重，分开效果差。?焦耳热使组分扩散严重（电泳电流大）。（2）高效毛细管电泳在技术上的两项重要改进：?采用了极细内径的毛细管（25~75?m），减小了焦耳热导致峰扩展（毛细管散热效率高）?采用了数千伏的高压（20~30kV），加高电场后，离子迁移速度加快，减小了组分扩散。?电渗流现象：在电场作用下，管中溶液整体向负极移动，形成电渗流

分开过程：

?正离子：电泳、电渗同向→最先出峰?中性粒子：迁移速度=电渗速度，次之?负离子：电泳、电渗反向→最终出峰

2、仪器装置

?毛细管柱中充入缓冲溶液，柱两端置于两个缓冲池中。?在缓冲池两个铂电极加高压。

?试样从一端进入，在另一端检测器。

?检测器同HPLC，常用紫外光度检测器（DAD）

（1）CE柱效：

n?(?ep??eo)V

（HPLC：H?1,与此不同）D2D式中——μep:电泳淌度；μeo：电渗淌度；V：外加电压；D：扩散系数。

『淌度：离子在介质中单位时间和单位场强下移动的距离。』?CE比HPLC分辩能力更高：①CE为平流，峰展宽小；HPLC为层流，峰展