均相LanthaScreen细胞分析

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BioTek应用手册

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药物筛选

一种常见的GPCR传感器-ERK1/2的自动均相磷酸化检测-均相LanthaScreen细胞分析

PaulHeldandPeterBanks,BioTekInstruments,Inc.Winooski,VT

KristinHuwiler,MatthewRobers,andBonnieHanson,LifeTechnologies,Madison,WI

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图3.LanthaScreen细胞试验概述。(A)表达GFP-ERK2融合蛋白的肝脏细胞被刺激后促进了ERK的磷酸化。(B)含有LanthaScreenTb-anti-ERK2[pThr185/pTyr187]抗体的LanthaScreen细胞裂解液加到细胞中。抗体结合使供体Tb和GFP之间产生能量转移，从而导致TR-FRET信号加强。总之，磷酸化的ERK1/2传感器采用了一种均相的TR-FRET免疫试验方法实现细胞水平上对ERK2蛋白转录后修饰的检测。

材料方法

ERK1/2磷酸化试验参考Huwileret.al.的方法略有修改，在加裂解buffer之前没有去除培养基。简单来说，稳定表达GPCR的细胞株以BacMamERK2试剂进行转染后冻存。BacMam处理的细胞在试验前解冻，用低浓度血清培养基(0.1%)清洗，384孔板培养(25μL培养基/孔),血清饥饿过夜。使用MicroFill分液器分别参与5μL含有冲动剂和不含冲动剂的培养基，室温孵育6-8分钟，时间长短取决于GPCR细胞株。使用MicroFlo分液器参与6μL的浓缩裂解buffer和LanthaScreenTb-anti-ERK2[pThr185/pTyr187]抗体混合液，细胞被直接裂解（没有吸出培养基），然后检测TR-FRET信号。(图4)

图4.自动化LanthaScreen试验步骤

对于D2多巴胺拮抗剂化合物的筛选，使用BacMamERK2转染的冻存D2多巴胺细胞被平铺在384细胞培板中(15,000个细胞/孔)培养过夜。次日，将Tocris化合物混合物(含1120种化合物)参与到细胞中使其终浓度为10μM。然后用MicroFill参与D2多巴胺冲动剂，终浓度为100nM。细胞室温孵育8分钟后，用MicroFlo参与裂解液和Tb-anti-ERK2[pThr185/pTyr187]抗体，2小时后检测TR-FRET信号。其次天重复筛选一次，然后将两天筛选出来的抑制活性低于cutoff的化合物评为“hits〞。每次筛选的hit的比率设定为6%（76/1120种化合物）。

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结果

试验对MicroFill注射器泵和MicroFlo蠕动泵分液器在分装ERK1/2裂解buffer的能力进行了测试。图5显示当使用荧光素作为示踪物的时候，这两种分液系统均可以确切和确凿地分装小体积(5μL)的各种裂解buffer。分液的CV值不超过2%

（未列举数据），信号差异不明显。

图5.试剂分液器的分液一致性。不同的分液器信号被用来分装5μL含有荧光染料的裂解buffer到384孔板的192个孔中。

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检测荧光信号。每个数据点代表16个孔的平均值。

图6自动化和手工步骤比较。使用BacMamERK2试剂转染HTR1AGeneBLAzerCHO细胞，试剂分别采用手工、MicroFill和MicroFlo分液系统进行分液。

对分液系统分液和手工分液在诱导冲动剂pERK1/2反应的能力上进行比较。MicroFill用来分5μL作为冲动剂的血清或作

为本底控制的培养基，而MicroFlo则用来加含Tb-anti-ERK2抗体的裂解buffer。如图6所示，LanthaScreen试验中，使用分液系统进行自动的试剂分液和使用手工分液得到的结果相当(图6)，且慢和快的自动分液速度也没有差异。统计学比较显示自动化分液的方法反应比率相对较小，但两者z’因子相当。（表1）

MicroFlo快速分液慢速分液手工分液Z’因子0.620.570.64反应比率

3.62

3.51

4.84

表1自动化和手工液体处理的统计学比较

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一个典型的试验中MicroFlo用来加含Tb-anti-ERK2抗体的裂解buffer，如图7所示。用不同浓度的BacMam病毒转染U2OS细胞，然后再用不同浓度的EGF刺激细胞。在该试验中细胞反应和预期一样，产生了大量的病毒。只有含有病毒的细胞会响应EGF刺激，且其响应取决于病毒载量。

图7四种不同浓度的BacMamERK2病毒转染U2OS细胞。其次天细胞采用EGF刺激6分钟，刺激终止后用含有LanthaScreenTb-anti-ERK2[pThr185/pTyr187]抗体的LanthaScreen裂解buffer裂解。检测TR-FRET信号，数据均一化为基本反应比。

采用MicroFill和MicroFlo自动分液器进行D2多巴胺冲动剂化合物库的筛选。散点图如图8所示。确定了1120个待测化合物的响应比率，同时通过对cutoff的确定，6%化合物(76/1120)被认定有抑制活性。Tocris库偏向于GPCR和离子通道结合化合物，因此6%cutoff标准是可以接受的。筛选又重复进行一次。如图8所示，大多数的化合物或者是不与D2多巴胺受体存在特异的相互作用，或者是一些已知的拮抗剂。这些化合物的发散率(GFP/Tb)是0.06-0.08。cutoff值为0.6%，发散率约为0.03的化合物在图中标绘出来（趋势线）。再次重复筛选，只有那些两次筛选都低于cutoff的被认定为真正的抑制剂（图8）。

图8文库筛选图。磷酸化-ERK1/2值来自单次筛选，用cutoff值表示。multiday抑制剂用红色数据点标识。

两次筛选的对照板统计学数据显示当试验自动化分液系统分液时，试验表现出较好的稳定性。所有测试板的Z’值都大于等于0.5（表2

）。

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表2.筛选的统计学分析。Z’因子计算源自每个384孔板的质控孔。

第一次筛选中67个化合物被评为‘hit’，被确定为D2多巴胺抑制剂。接下来的重复筛选中，55个在初次筛选被评为‘hit’的化合物再次被确定为抑制剂。在这55个被确定的复合物中，20个据报道是多巴胺的受体抑制剂，4个是已知的MEK抑

制剂。通过两次的筛选，确认了所有的D2多巴胺抑制剂。探讨

上述数据说明使用一些自动化的分液系统如BioTek公司的MultiFlo、MicroFlo和MicroFill分液系统,可以自动化的完成LanthaScreenERK2细胞试验中的加液工作。分液系统可以很好的控制加液的确凿性和确切性。通过平行的比较，在LanthaScreenERK2细胞试验中使用MicroFill和MicroFlo加液比手工加液的出错几率要小，表现在较低的标准偏差。而使用MicroFill和MicroFlo的加液的相应系数比手工加液要略低，而精度改进后Z’值则相当。

机器和试验的相结合可以提供给我们重要的生物信息。采用BacMam系统，通过把ERK2-GFP瞬时转染到大量细胞中，使用ERK1/2LanthaScreen试验的方法拓宽了