数字恒温 CRISPR 技术-液滴微流控与恒温扩增的联合应用

———数字恒温CRISPR技术-液滴微流控与恒温扩增的联合应用

CRISPR-Cas系统自问世以来，从作为基因编辑的利器开始，发展至今已成为核酸检测的新型工具。特别是近年来，新型冠状病毒的快速检测需求增大。国内多位专家已发表过多篇应用CRISPR-Cas技术快速、灵敏地检测新冠病毒的文章。但目前基于CRISPR技术的检测仍以定性检测为主，定量检测仍有方法学上的难度。因此，在保证能定量研究的前提下确保检测方法的灵敏度、特异性和时效性是如今研究的下一个重点。达普生物的联合创始人姚舒怀教授团队利用液滴微流控技术，在CRISPR诊断领域合作取得新的进展。姚教授团队将RPA扩增与Cas13a检测融合为一步法MEDICA（Microfluidics-EnabledDigitalIsothermalCas13aAssay），此方法不仅减少了CRISPR技术的检测时间，而且保证了检测方法的灵敏度、特异性，更是实现了对检测目标的绝对定量。该成果发表于分析化学领域的顶级期刊AnalyticalChemistry，影响因子8.008。

香港科技大学姚舒怀团队发现，大多数CRISPR检测诊断平台通过检测荧光或条带，得到一个可视化、定性的结果。当需要相对定量的时候，需要RPA扩增及Cas13a检测两个步骤，并且使用荧光定量PCR通过一定的扩增循环与荧光检测来实现。这给工作流程带来更多的不确定性，且定量还会受到标准曲线的限制与影响。在本文中，姚教授将RPA反应与Cas13a检测通过微流控技术结合到一步法中（MEDICA），不仅提升了检测灵敏度，而且实现了稳定的绝对定量。

使用达普液滴微流控技术，将水相1（检测模板、预混液）与水相2（MgOAc）在需要反应时进行混合，混合后的水相与油相在微流控芯片中生成微液滴，再进行恒温反应。初始模板在分配进微液滴时符合泊松分布，因此可以根据泊松分布模型进行绝对定量的计算工作。

本文在试验优化及验证阶段，姚教授团队通过不同浓度及pH的Tris-HCL、不同浓度的盐条件（NH4(SO4)2,NaCl,KCl,CH3COOK）及不同浓度的PEG、Tween-20、引物探针等进行摸索试验，最终选定了一个最佳的优化条件。在确定了反应最佳条件后，姚教授团队使用HPV16质粒构建并且验证了一步法RPA+Cas13a于微流控体系中（数字恒温CRISPR方法）。上图可见，构建的数字恒温CRISPR方法灵敏度达到1~5copies/L，稳定性也表现出色。为了检验方法学在实际临床应用中的性能，姚教授团队使用质粒进行线性关系验证与临床样本进行验证，结果均展现较好的一致性。姚教授团队构建的数字恒温CRISPR方法与临床使用qPCR方法检测HPV16/HPV18结果对比，阴阳性符合率达到100%，并且将CT值与数字恒温CRISPR方法得到的绝对定量结果做相关性分析，R＞0.95/0.93（HPV16/HPV18）。方法学产生差异的原因可能是qPCR标准品是由质粒代替，在低浓度下（CT值36左右）与临床样本具有一定的差异性。另外，qPCR会因为基因的偏好性，而展现出不同的扩增效率。由此可见，数字恒温CRISPR方法无需依赖标准品即可进行绝对定量，并且可以带来更快的检测速度和更灵敏的检测下