CHO细胞外泌体的分离和表征技术

———CHO细胞外泌体的分离和表征技术

CHO细胞是一种广泛用于生物制药蛋白质生产的宿主。CHO细胞中分离外泌体主要采用聚合物的沉淀(PBP)技术从分批培养中分离和富集细胞外泌体囊泡。分离后的外泌体可以通过多种方法来检测和表征分离的囊泡，这些分析包括动态光散射(DLS)和Zeta电位测量、电子显微镜(EM)和外泌体标记物分析、RNA和脂质分析等。

一、细胞培养

1.培养基与细胞

细胞可使用CHO系中的CHO-S细胞。

培养基使用CD-CHO培养基（ThermoFisher）。在培养基中添加8mML-谷氨酰胺利于CHO细胞生长。

2.培养：

培养物通常在锥形瓶中以20ml分批培养模式在二氧化碳振荡培养箱中37C下以120rpm摇动培养。细胞每3-5天传代一次，接种率为0.2106个活细胞/ml。对于制备外来体制剂的分批培养，将细胞以0.2106个活细胞/ml接种在20ml培养物中，然后在培养的第3天和第5天收获上清液。

3.收获：

收获后的样本，细胞沉淀物和5个3106细胞沉淀物样品进行等分，用于细胞脂质和蛋白质分析。通过高速离心机以2,000g离心5分钟沉淀细胞，并储存在-80C超低温冰箱中。所有剩余的培养物上清液都用于分离外泌体，如下所述。

二、通过聚合物沉淀法(PBP)制备外泌体

根据制造商的指南，使用TEI总外泌体分离试剂盒（Invitrogen）从培养基中分离外泌体。将细胞培养基以2000g离心30分钟以去除细胞和任何碎片；随后将上清液小心移至离心管管中，加入0.5倍体积的TEI试剂，充分混合并在4C下孵育过夜。然后将样品在4C下以10,000g离心1小时，然后在弃去上清液后，将富含外泌体的颗粒重新悬浮在75lPBS缓冲液中。然后将样品储存在-20C下，直到需要进行后续分析。

外泌体的表征分析

1.动态光散射

使用Anton-PaarLightsizer500粒子分析仪测定外泌体制剂中的粒度分布。动态光散射测量由于溶液中粒子的布朗运动引起的散射光强度的动态波动，（685nm的激光，检测角度为15、90、175度）；较小的粒子比较大的粒子移动得更快。

确定颗粒大小时，通常使用三种分布类型：

(1)数量分布，报告不同大小"箱'中的颗粒数量；

(2)体积分布报告不同尺寸类别的颗粒总体积；

(3)强度分布，报告不同大小颗粒散射的光。

也可以使用高分辨率纳米粒径分析仪NanocoulterⅠ来分析样品中每种大小的囊泡的实际数量、浓度及粒子动态、Zeta电位等。

为了进行分析，将先前储存在-20C的75l等分试样的外泌体制剂用925lPBS稀释（得到1ml）并转移到一次性比色皿中用于DLS测量。每个样品在DLS和Zeta电位实验中测量五次，如下所述。

2.Zeta电位

通过电泳光散射(ELS)测量的Zeta电位测量粒子在电泳场中的速度。Zeta电位是胶体分散体稳定性的指标（绝对值）和囊泡表面电荷的量度（+或-符号）。

3.电子显微镜分析

对于电子显微镜分析，外泌体制剂在PBS缓冲液中按1:10稀释，随后在等体积的4%(w/v)多聚甲醛和1%(v/v)戊二醛中固定5分钟。然后将样品置于formvar-carbon涂层的600目铜网格上，并在室温下干燥5分钟。随后将样品在乙酸双氧铀溶液（2%水溶液）中进行对比，并在电子显微镜（Jeol1230TEM）下观察，加速电压为80kV，并连接到数码相机进行观察.

三、Bradford分析法测定样品中的蛋白质含量

为了量化培养第3天和第5天的CHO细胞沉淀物和外来体制剂中的蛋白质含量，对细胞裂解物以及外来体裂解物和75l等分试样（每份均来自1ml培养物）进行Bradford测定非裂解外泌体。通过向细胞或外泌体制剂中添加先前描述的裂解缓冲液来制备裂解物。

1.SDS和蛋白质印迹

对裂解和未裂解的外泌体制剂以及分批培养第3天和第5天的细胞裂解物进行蛋白质印迹。所有样品均在还原（含有-巯基乙醇）或非还原Laemmli样品缓冲液中制备，在95C下煮沸5分钟，随后如前所述通过12%SDS分离。每个蛋白质样品上样约5g。以下一抗用于已知外泌体标记物的蛋白质印迹；抗CD63（SantaCruz，sc-5275）、抗CD81（SantaCruz，sc-166029和sc-23962）和抗TSG101（SantaCruz，sc-136111）。

2.RNA分离和分析

从收获的第3天和第5天的3个外泌体样本中提取总RNA。根据制造商的说明，使用总外泌体RNA(TER)和蛋白质分离试剂盒（Invitrogen）提取RNA。从源自1ml培养物的每个外泌体样品中洗脱出30-35lRNA。然后使用NanoDropND-1000分光光度计估计回收的RNA总量。

3.脂质分析

从(a)总细胞沉淀中提取脂质（1106个活细胞，在第3天收获时含有298.9g蛋白质，在第5天收获时含有477.2g蛋白质），储存在-80C，和（b)从71ml培养物中分离出的合并外泌体（即我们在每个时间点从1ml培养物中分离出775l等分试样，然后将它们合并在一起）.然后通过向细胞/外泌体制剂