猪群常见疾病实验室诊断技术

猪群常见疾病实验室诊断技术第1页/共85页张桂红博士、教授、博士生导师华南农业大学兽医学院手机公电话mail：guihongzh@QQ：806976682QQ群：154149670联系方式第2页/共85页注意事项上课时间：2011年11月30日全天报到，12月1日～6日实验技能培训。上午8：30上课，下午2：30上课实验培训地点：华南农业大学兽医学院传染病实验室（即新兽医大楼102房）第3页/共85页安全问题：吃饭：各饭堂、宾馆等外出：地铁3号线A出口地址：天河区五山路483号华南农业大学第4页/共85页组别组员第一组叶素萍、楼平儿、李波第二组杜海军、周苏明、张宝生第三组梁培新、李孔定、林志清第四组伍武锋、犹银俊、秦锋、张硕第五组王爱国、赵杨、梁田英第六组李佳、王美燕、朱德文、龚胜初第七组赵刚、张树权、梁仲英、孙建阳第八组冯杰、梁达威、王迪第九组闫彦爽、赵京涛、向卫军第十组蓝洁丽、陈燕飞、陈揽月、夏惠焰第5页/共85页猪病越来越多、越来越复杂诊断依据：病理剖检变化、流行病学资料、实验室诊断、生产记录等判定疑似疾病常见猪病的诊断第6页/共85页发病猪日龄发病率、死亡率生产、繁殖记录采食和饮水情况温度免疫情况用药情况……第7页/共85页细菌的染色↓形态学观察↓培养基的制备↓细菌分离培养↓移植↓细菌的生化试验↓药物敏感试验病猪的现场剖检病猪病料的采集、保存总RNA的提取↓反转录↓聚合酶链式反应（PCR）

猪瘟病毒抗体猪伪狂犬病病毒gPI抗体(野毒)

猪流感血凝抑制试验猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体↓DNA提取↓PCR血清学检测分子诊断细菌分离↓结果分析第8页/共85页日程安排上午下午1日（周四）概述：（讲授）猪的现场剖检；病料的采集猪病的流行情况；病料的采集、运输与保存实验部分：细菌的分离2日（周五）病毒核酸RNA的提取；反转录；PCR扩增细菌的革兰氏染色；细菌的形态学观察；细菌的纯培养；常用细菌培养基的制备3日（周六）电泳观察PCR结果；分离细菌的生化特性鉴定；药敏试验病毒核酸DNA的提取；PCR扩增电泳观察PCR结果4日（周日）药敏试验结果观察；生化特性结果观察；病理组织切片观察（王衡）猪血清的ELISA检测；流感病毒的血球凝集抑制实验血清前处理5日（周一）流感病毒的血球凝集抑制实验学员自己整理实验结果；提出相关问题6日（周二）上述检测结果的分析；实验中所遇问题的分析学员可根据具体情况再补做相关实验第9页/共85页第一部分猪的现场剖检检查外观部位：眼、口、鼻、皮肤、肛门检查器官：淋巴结、心脏、肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、肾、膀胱、浆膜及浆膜腔、睾丸、肌肉、脑等猪的常规检查第10页/共85页剖检注意事项个人防护怀疑炭疽时不能剖检第11页/共85页第12页/共85页第13页/共85页一、体表检查：1、鼻分泌物

a、SI（黏液）b、肺疫（气泡）c、氨气（分泌物多）

2、鼻中隔

a、沿臼齿锯开，鼻中隔不对称（萎鼻）3、眼睛

a、凹下去（脱水）b、发黑（CSF、链球等败血症）4、皮肤

a、毛孔出血（弓形体、附红体）b、皮下出血（CSF、链球、副伤寒等败血症）5、腹股沟淋巴结

a、水肿（副猪等细菌毒素）b、周边出血（PCV2）c、大理石样出血（CSF）第14页/共85页二、胸腔检查之呼吸系统1、扁桃体

a、白色坏死点（PR）2、喉头

a、出血点（CSF）b、充血（急性肺疫-常见于母猪）3、气管分泌物

a、黏液（SI）b、脓性分泌物（链球）c、气泡性分泌物（肺疫）第15页/共85页正常猪肺第16页/共85页第17页/共85页第18页/共85页第19页/共85页第20页/共85页第21页/共85页第22页/共85页二、呼吸系统常见疾病一览表（肺脏）病原浮水实验病理变化PRRSV浮肺间叶增长，典型间质性肺炎PCV2浮前期变化不明显，后期橡皮肺CSF浮明显出血点SI浮黏液性分泌物，实变界限明显，出血明显PRV浮白色坏死点巴氏杆菌沉气泡性分泌物副猪嗜血杆菌沉出血斑，有可能有肺水肿链球菌沉脓性分泌物沙门氏菌沉出血斑放线杆菌沉膈叶有白色部分凸出，出血，12周龄以上中大猪支原体沉心叶，间叶虾肉样变明显，对称性病变弓形体沉肺水肿霉菌毒素沉肺水肿第23页/共85页三、剖检之脏器检查（1）1、心脏a、心包炎，心包液增多，有胸膜炎、腹膜炎、关节炎（副猪）b、心包炎，心包液增多（VE缺乏）c、心肌出血点（CSF）d、心肌出血斑（副猪）e、心肌条纹状出血，虎斑心（FMD）f、心瓣瓣膜敖状物（猪丹毒）第24页/共85页2、肝脏

a、颜色发黄（药物中毒、弓形体、PCV2、附红体）b、出血斑（细菌毒素）c、出血点（CSF）d、白斑（蛔虫）3、胆囊

a、胆囊壁变厚（链球菌）b、胆囊壁出血（CSF）c、胆汁变浓（可能不是疾病引起，饮水器坏了，只吃料不喝水会引起这种现象）第25页/共85页三、剖检之脏器检查（2）4、脾脏

a、松脆、肿大（丹毒、链球菌）b、白色坏死点（PRV）d、不规则梗死，边缘锯齿状（PCV）e、规则倒三角状梗死（CSF）5、肾脏

a、出血斑（细菌毒素）b、比较零星出血点（温和性CSF）c、出血点较多（PCV2、附红体）d、出血点密密麻麻大小均一（PRV前期）e、出血点密密麻麻大小不均一，雀斑肾（CSF）f、肾皮质纹理粗乱（霉菌毒素）g、肾盂结晶（药物配伍不好，有可能是磺胺药用量过大，过多）h、肾上腺有白色坏死点（PRV）第26页/共85页6、膀胱

a、浆膜出血斑点（副猪）

b、粘膜出血点（CSF）第27页/共85页四、消化系统检查1、口腔

a、口腔溃疡（霉菌毒素、PRV）2、肠系膜淋巴结

a、索状肿（PCV）3、胃

a、溃疡，充血（霉菌毒素、饲料颗粒不适、硫酸铜含量高、PCV2）第28页/共85页猪肠道1.小肠：均位于右侧(1)十二指肠：十二指肠系膜下，位置较固定。十二指肠结肠韧带常作为十二指肠与空肠的分界。(2)空肠：空肠肠袢。

(3)回肠：是小肠较短的一段，回盲韧带是回肠与空肠分界标志。第29页/共85页2.大肠：位于左侧。（1）盲肠：圆筒状，盲肠尖向后，由3条明显的纵带，有回盲瓣（周围淋巴组织发达）。（2）结肠：形成肠圆锥，分旋袢（向心回、离心回各3圈）和终袢两部分。（3）直肠：周围脂肪丰富，又称肥肠.有直肠壶腹。猪肠结构第30页/共85页第31页/共85页4、肠道a、整个肠道变薄，有水（卡他性肠炎，大肠杆菌）b、肠道有出血点（CSF）c、肠内可见明显鼓气（梭菌性肠炎）d、结肠袢白斑（副伤寒-保育猪、节结虫-中大猪）e、肠系膜胶冻样水肿（PCV2）f、拉稀粪便有黏液（密螺旋体）g、肠内皱褶增多到出血坏死不等（回肠炎-中大猪）h、回盲瓣纽扣样溃疡（CSF）第32页/共85页五、脑部检查1、脑

a、水肿（脑膜脑炎性链球、副猪、大肠杆菌、）b、出血（CSF、PRV）c、食盐中毒也会引起脑部病变，有神经症状第33页/共85页器官病理变化可能发生的疾病淋巴结颌下淋巴结肿大，出血性坏死全身淋巴结有大理石样出血变化咽、颈及肠系膜淋巴结黄白色干酪样坏死灶淋巴结充血、水肿、小点状出血

支气管淋巴结、肠系膜淋巴结髓样肿胀猪炭疽、链球菌病猪瘟猪结核急性猪肺疫、猪丹毒、链球菌病猪气喘病、猪肺疫、传染性胸膜肺炎、副伤寒第34页/共85页睾丸1个或2个睾丸肿大、发炎、坏死或萎缩乙型脑炎、布氏杆菌病第35页/共85页第二部分病料的采集、运输与保存血清：2-5mL，不能溶血各组织脏器：新鲜、尽量无菌、不能相互污染疑似病毒性疾病，-20℃以下保存疑似细菌性疾病，尽快分离，4℃保存第36页/共85页采样注意事项个人防护典型病变：具有代表性、针对性尽量无菌适时采样合理采样适量采样第37页/共85页采样的时机是否适宜样品是否具有代表性样品处理、保存、运送是否合适及时

与检验结果的准确性、可靠性关系极大。一、标本的采集、运送和保管的一般要求第38页/共85页采集检验样品时，需要符合以下规定：

1．适时采样根据检疫要求及检验项目的不同，选择适当的采样时机十分重要。样品是有时间要求的，应严格按规定时间采样；有临诊症状需要作病原分离的，样品必须在病初的发热时或症状典型时采样，病死的动物，应立即采样。第39页/共85页2．合理采样按照检疫规定要求，须严格按照规定采集各种足够数量的样品外，不同疫病的需检样品各异，应按可能的疫病侧重采样。对未能确定为何种疫病的，应全面采样。3．典型采样选取未经药物治疗、症状最典型或病变最明显的样品，如有并发症，还应兼顾采样。

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4.无菌取样采集检验样品除供病理组织学检验外，供病原学及血清学等检验的样品，必须无菌操作采样，采样用具、容器均须灭菌处理，尸体剖检需采集样品的，先采样后检查，以免人为污染样品。

5.适量采样采集样品第41页/共85页2-5mL一次性注射器采血，将采完血样的注射器活塞，微微拔出一些，使针筒内留有部分空气，然后盖好针头盖子，将注射器针头向上成30度角，斜放，等待血液完全凝固（大概10分钟到30分钟），此过程中不能移动注射器，防止溶血。使用试管和青霉素瓶时也是一样。（1）血样采集、保存和运送第42页/共85页用无菌棉拭子在咽部涂抹数次后，放入含0.5-2ml生理盐水、Hank液、DMEM的试管中，棉拭子接触手的部分应及时折断或剪断去掉，然后盖紧试管。（2）鼻、咽拭子的采集：第43页/共85页对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分；液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便2～5ml；成形粪便至少取蚕豆大小粪便1块（约5g）放于灭菌容器内，最好加有保存液或增菌液；若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4～5cm深处轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检（3）粪便标本：第44页/共85页用于各种病毒性疾病病原检测病料的采集和保存以下提到病料样品，如不是直接进行实验，都需要冷冻保存（-20℃）以下！采集样品分开放置，防止交叉污染（4）病毒性疾病病原检测病料第45页/共85页保证整个过程中，病料始终处于低温状态，十分重要。一个简单的方法是，用废弃的矿泉水瓶，灌水后，放置在冰箱中，制备冰块，在病料运输时，将足量的冰块和病料一起放置在保温箱中（用冰块包裹所有病料，如果冰块不够多，最好将冰块放置在病料的上面和下面。密封后，由专人快速运送到检测单位。第46页/共85页分离病毒的组织病料：可放于50％甘油缓冲液中（pH8.0），在5℃条件下保存数周，也可用由0.5％水解蛋白，2％小牛血清，青、链霉素各500U／ml，制霉菌素50U／ml组成的溶液保存。5－10％蛋黄生理盐水。第47页/共85页（5）细菌性疾病病料的采集、运送在选择细菌性疾病病原检测病料时，要选择有代表性的病例。未经抗生素治疗的病猪（最近1周未经抗生素治疗）。有条件的最好选用活体送检。第48页/共85页如果是用于细菌分离的病料，必须新鲜运送，并保证整个过程中，病料始终处于低温状态（但绝对不能结冰），即4℃采样尽量无菌操作，保证无人为的污染第49页/共85页水样：水样来源主要是地下水、自来水、猪槽等。采样器具有用于手工采样的采样瓶和自动采样器。手工采样是将水样瓶用铁架固定，塞住瓶口，待瓶沉入到一定深度时拉开瓶塞，让水样进入。水样？第50页/共85页用于调查中毒的样品：包括中毒猪的呕吐物、排泄物等。胃内容物：是确定中毒的最好样本之一。所采集的样本可用玻璃、聚乙烯或聚四氟乙烯器皿盛装，避免使用金属器皿。采集量最好达到1OOg（ml）以上。调查中毒的样品：第51页/共85页

二、疑似病原后的具体的采样部位第52页/共85页猪瘟（CSFV）病毒分离荧光抗体试验（FAT）ELISART-PCR中和试验……白细胞减少

扁桃体淋巴结肺脏精液血清（病毒血症时间短）抗体及抗原第53页/共85页血清肺脏淋巴结精液扁桃体蓝耳（PRRSV）第54页/共85页伪狂犬脑扁桃体肝、脾口、咽腔拭子（活体）第55页/共85页圆环病毒诊断PCVDPCR原位PCR(ISH)免疫组织化学(IHC)诊断PMWS和PDNS，最好定量检测，因为：PMWS感染猪与PCV2亚临床感染猪区别在于PCV2的感染量血清学诊断存在一定的问题！第56页/共85页肺脏淋巴结(各部位)脾……圆环病毒第57页/共85页猪细小（PPV）胎儿（小于16cm）或胎儿肺脏妊娠大于70天木乃伊胎、死胎不能用于诊断检测病毒血凝素（在没有抗体时）病毒分离不适合检测新生仔猪抗体第58页/共85页JEV胎儿、死胎、新生仔猪、青年猪病毒分离胎儿或新生仔猪取脑、肝、脾、肺和胎盘第59页/共85页PEDV和TGEV小肠、小肠上皮（哺乳仔猪小肠切片的直接免疫荧光、免疫组化）粪便RT-PCRELISA第60页/共85页口蹄疫水疱液水疱皮第61页/共85页猪流感口、咽拭子肺脏气管分泌物第62页/共85页猪脑心肌炎

心脏扁桃体第63页/共85页细菌性疾病

普通琼脂血液琼脂

LB固体培养基

TSATSB……重点是选择合适的培养基第64页/共85页猪副嗜血杆菌肺浆膜表面物质渗出性脑脊髓液心脏血液心包积液关节液需要NAD和V因子第65页/共85页（1）TSA固体培养基：准确称取胰蛋白大豆琼脂（TryptoneSoyaAgar，TSA）40克，加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，120℃高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD，充分摇匀后倒平皿。（2）TSB液体培养基：准确称取胰蛋白大豆肉汤（TryptoneSoyaBorth，TSB）30克溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后120℃高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD即成。第66页/共85页胸膜肺炎放线杆菌G—损伤的肺组织革兰氏染色绵阳血琼脂分离巧克力血琼脂特殊的生化特性：

CAMP检测尿素酶第67页/共85页链球菌肺、关节液、脑等血液琼脂第68页/共85页大肠杆菌肠道内容物粪便第69页/共85页萎缩性鼻炎肺鼻分泌物血液琼脂1％葡萄糖麦康凯琼脂第70页/共85页肺炎支原体非常难分离生长时间4周核酸检测抗体检测第71页/共85页谢谢！第72页/共85页下午实验内容细菌的分离、培养病料的研磨第73页/共85页TSA血液平板病料的研磨反复冻融病料第74页/共85页肺出血斑点纤维素性肺炎心叶、尖叶、中间叶肝样变水肿，小点状坏死粟粒性、干酪样结节猪瘟猪肺疫、传染性胸膜肺炎气喘病弓形体病结核病心脏心外膜斑点状出血心肌条纹状坏死带纤维素性心外膜炎心瓣膜菜花样增生物心肌内有米粒大灰白色包囊泡猪瘟、猪肺疫、链球菌病口蹄疫猪肺疫慢性猪丹毒猪囊尾蚴病第75页/共85页肝坏死小灶胆囊出血沙门氏菌病、弓形体病、李氏杆菌病、伪狂犬病猪瘟、胆囊炎脾脾边缘有出血性梗死灶稍肿大，呈樱桃红色郁血肿大，灶状坏死脾边缘有小点状出血猪瘟、链球菌病猪丹毒弓形体病仔猪红痢第76页/共85页胃胃粘膜斑点状出血，溃疡胃粘膜充血、卡他性炎症，呈大红布样粘膜下水肿猪瘟、胃溃疡猪丹毒、食物中毒水肿病小肠粘膜小点状出血节段状出血性坏死，浆膜下在小气泡以十二指肠为主的出血性、卡他性炎症猪瘟仔猪红痢仔猪黄痢、猪丹毒、食物中毒大肠盲肠、结肠粘膜灶状或弥漫性坏死盲肠、结肠粘膜扣状溃疡卡他性、出血性炎症粘膜下高度水肿慢性副伤寒猪瘟猪痢疾、胃肠炎、食物中毒中肿病第77页/共85页肾苍白，小点状出血高度郁血，小点状出血苍白、变黄、脆猪瘟急性出血圆环病毒病膀胱粘膜层有出血斑点猪瘟第78页/共85页肌肉臀肌、肩甲肌、咬肌等外有米粒大囊泡肌肉组织出血、坏死，含气泡腹斜肌、大腿肌、肋间肌等处见有与肌纤维平行的毛根状小体猪囊尾蚴病恶性水肿住肉孢子虫病血液血液凝固不良链球菌病、中毒性疾病第79页/共85页主要症状可能涉及的疾病仔猪下痢红痢、黄痢、白痢、传染性胃肠炎、流行性腹泻、轮状病毒感染、猪痢疾、副伤寒、空肠弯曲菌病、腺病毒感染、鞭虫病、胃肠炎、球虫病呼吸困难气喘病、猪肺疫、流感、接触传染性胸膜肺炎、传染性萎缩性鼻炎第80页/共85页神经症状猪水肿病、乙型脑炎、李氏杆菌病、伪狂犬病、仔猪先天性肌陈痉、神经型猪瘟、链球菌病、传染性脑脊髓炎，食物、药物或农药中毒流产或死胎猪细小病毒感染、乙型脑炎、猪瘟、布