生物信息学高通量测序技术及数据分析

生物信息学高通量测序技术及数据分析第1页/共46页高通量测序技术及数据分析介绍背景介绍第一代测序技术第二代（高通量）测序技术基因芯片与高通量测序的比较高通量测序技术的应用高通量测序数据分析概览高通量测序数据质量评估与过滤基因组测序RNA-seqChIP-seqUCSCGenomeBioinformatics第2页/共46页背景介绍第3页/共46页背景介绍第一代测序技术Sanger测序法链终止法双脱氧终止法1975年Transcription/s/blog_7110867f0100zi09.htmlFrederickSanger弗雷德里克·桑格1918年8月13日－2013年11月19日1958年诺贝尔化学奖1980年诺贝尔化学奖第4页/共46页背景介绍第二代测序技术边合成边测序2005年左右Sequencingbysynthesis代表性测序技术Illumina/SolexaRoche/454ABI/SOLiDPolonatorHeliScope参考文献Metzker,M.L.(2010).Sequencingtechnologies-thenextgeneration.NatRevGenet11,31-46./nrg/journal/v11/n1/full/nrg2626.htmlIlluminaHiSeq2500第5页/共46页背景介绍高通量测序文库构建单末端测序，single-end首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow

cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列。双末端测序，paired-end在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序。第6页/共46页背景介绍以Illumina为例简单介绍测序原理IlluminaHiSeq2500cBot第7页/共46页背景介绍高通量测序数据格式fasta序列文件的第一行是由大于符号（>）打头的任意文字说明，主要为标记序列用。从第二行开始是序列本身，标准核苷酸符号，通常核苷酸符号大小写均可fastq第一行由‘@’开始，后面跟着序列的描述信息，这点跟fasta格式是一样的；第二行是序列；第三行由‘+’开始，后面也可以跟着序列的描述信息；第四行是第二行序列的质量评价（qualityvalues），字符数跟第二行的序列是相等的。第8页/共46页背景介绍高通量测序数据格式fastqQ=-10log10(p)ORQ=-10log10[p/(1-p)](p：碱基错误率)字符的ASCII值-64=质量值

OR

字符的ASCII值-33=质量值NCBI/SangerorIllumina1.8andlater.UsingaPhredscaleencodedusingASCII33to93.ThisisthestandardforfastqformatsexceptfortheearlyIlluminadataformats(thischangedwithversion1.8oftheIlluminaPipeline).IlluminaPipeline1.2andearlier.UsingaSolexa/Illuminascale(-5to40)usingASCII59to104.TheWorkbenchautomaticallyconvertsthesequalityscorestothePhredscaleonimportinordertoensureacommonscaleforanalysesacrossdatasetsfromdifferentplatforms(seedetailsontheconversionnexttothesamplebelow).IlluminaPipeline1.3and1.4.UsingaPhredscaleusingASCII64to104.IlluminaPipeline1.5to1.7.UsingaPhredscaleusingASCII64to104.Values0(@)and1(A)arenotusedanymore.Value2(B)hasspecialmeaningandisusedasatrimclipping.ThismeansthatwhenselectingIlluminaPipeline1.5andlater,thereadsaretrimmedwhenaBisencounteredintheinputfileiftheTrimreadsoptionischecked.363939393939393939393839393636343429312202019191938383836363636363630323535第9页/共46页基因芯片与高通量测序的比较第10页/共46页芯片与测序比较基因芯片约20年的历史，技术比较成熟，成本相对较低原理探针，互补配对的原则靶序列用荧光标记通过荧光强度间接反映靶序列的数量应用检测已知基因的表达水平检测SNP位点的基因型检测CNV第11页/共46页芯片与测序比较高通量测序约10年的历史，发展快速，成本逐步减少原理边合成边测序碱基用荧光基团标记直接测定碱基序列应用全基因组测序转录组测序(smallRNAseq,RNA-seq)，可以检测已知基因的表达水平，可以发现全新的转录本ChIP-seqCLIP-seq,…第12页/共46页芯片与测序比较用高通量测序技术和基因芯片技术检测基因表达Malone,J.H.,andOliver,B.(2011).Microarrays,deepsequencingandthetruemeasureofthetranscriptome.BMCBiol9,34.第13页/共46页高通量测序技术的应用第14页/共46页测序应用高通量测序数据分析概览第15页/共46页测序应用QualityAssessmentRawDataFastQC;fastx_quality_statsRemoveadaptor/linkerfastx_trimmerfastx_clipperSplitaccordingtobarcodefastx_barcode_splitter.plfastx_trimmerQualityControlfastq_quality_trimmerfastq_quality_filterFurtherAnalysis高通量测序数据质量评估与过滤FastQCFASTX-Toolkit第16页/共46页测序应用全基因组denovo测序第一期：基因组调研图整体测序深度不低于20倍覆盖度。进行初步的数据分析，对基因组大小，GC含量等做出初步评估，确定框架图梯度文库构建具体策略第二期：基因组框架图基因组覆盖度达到90%以上，基因区覆盖度达到95%以上，单碱基的错误率达到1万分之一以内，整体测序覆盖深度不低于60倍覆盖度。同时对框架图进行基本基因注释和功能注释，和简单的比较基因组学分析。第三期：基因组精细图基因组覆盖度达到95%以上，基因区覆盖度达到98%以上，单碱基的错误率达到10万分之一以内，整体基因组覆盖度不低于100倍，ScaffoldN50大小不低于300Kb，对基因组精细图进行详细基因注释，基因功能注释，基因代谢途径注释和比较基因组学分析。第17页/共46页全基因组denovo测序数据拼接组装算法流程DeBruijnGraph(德布鲁因图)Read：AGATACTk-merAGAGATATATACACTAGAGATATATACACT…测序应用第18页/共46页全基因组重测序(外显子组测序)算法流程发现遗传变异（SNP，indel等）测序数据与参考基因组做比对重新校对测序质量打分每一种基因型的先验概率对基因型做推断计算每一种基因型的概率测序应用第19页/共46页测序应用转录组测序SmallRNAseq检测smallRNA（主要是miRNA）的表达水平发现新的smallRNARNA-seqPoly(A)检测蛋白质编码基因的可变剪切体及表达水平TotalRNA(exceptrRNA)检测mRNA及longnoncodingRNA的表达水平发现新的longnoncodingRNA数据分析工具Bowtie(/index.shtml)TopHat(/software/tophat/index.shtml)Cufflinks(/)第20页/共46页测序应用RNA-seq数据分析工具BowtieBowtieisanultrafast,memory-efficientshortreadalignergearedtowardquicklyaligninglargesetsofshortDNAsequences(reads)tolargegenomes.TopHatTopHat

isafastsplicejunctionmapperforRNA-Seqreads.CufflinksCufflinks

assemblestranscripts,estimatestheirabundances,andtestsfor

differentialexpressionand

regulation

inRNA-Seqsamples.ColeTrapnell:TopHat(2009),Cufflinks(2010)PhDStevenSalzberg,

UniversityofMarylandLiorPachter,UniversityofCalifornia,

BerkeleyPostdocJoinRinn’slab,TheBroadInstitute第21页/共46页测序应用OverviewofTopHat第22页/共46页测序应用SplicingJunctionsExonskipping

or

cassetteexonMutuallyexclusiveexonsAlternativedonorsiteAlternativeacceptorsiteIntronretention第23页/共46页测序应用TopHat:DiscoveringsplicejunctionsTopHatv1.0.7earlierseed-and-extendalignmentTopHatv1.0.7andlaterSupposeSisareadoflengthlthatcrossesasplicejunctionsplitsSintonsegments,n=floor(l/k),(k=25bp)mapsthesegmentss1,…,snwithBowtietothegenomesegmentssi,si+1thatbothaligntothegenome,butnotadjacentlyasegmentsifailstoalignbecauseitcrossesasplicejunction,butsi-1

andsi+1arealigned.第24页/共46页测序应用TopHat:DiscoveringsplicejunctionsTopHatv1.0.7andlaterasegmentsifailstoalignbecauseitcrossesasplicejunction,butsi-1

andsi+1arealigned.si-1Si+1si12345678910111213141516171819202122232425simbpk-mbpm=1,…,24m=12第25页/共46页测序应用OverviewofCufflinks第26页/共46页测序应用转录本拼接算法中涉及到的概念偏序关系与偏序集合PartialorderandPartiallyorderedset偏序关系偏序（亦称半序）关系是定义在集合上的一种序结构，是集合上满足一定条件的二元关系。直观的说，偏序指集合中仅有部分成员之间可以排序。全序关系在集合

A

中，存在偏序关系“≤”，如果对于任意

a∈A,

b∈A,有

a≤b

或

b≤a，即

A

中的每对元素都满足关系“≤”，则集合

A

上的偏序

“≤”是全序的或线性次序的。直观来说，全序指集合中全体成员之间都可以进行比较，可以排出所有元素的顺序。偏序集合指配备了偏序关系的集合第27页/共46页测序应用转录本拼接算法中涉及到的概念偏序关系非严格偏序，自反偏序给定集合S，“≤”是S上的二元关系，若“≤”满足：自反性：∀a∈S，有a≤a；反对称性：∀a，b∈S，a≤b且b≤a，则a=b；传递性：∀a，b，c∈S，a≤b且b≤c，则a≤c；则称“≤”是S上的非严格偏序或自反偏序严格偏序，反自反偏序给定集合S，“<”是S上的二元关系，若“<”满足：反自反性：∀a∈S，有a≮a；非对称性：∀a，b∈S，a<b⇒b≮a；传递性：∀a，b，c∈S，a<b且b<c，则a<c；则称“<”是S上的严格偏序或反自反偏序。第28页/共46页测序应用转录本拼接算法中涉及到的概念偏序集合链偏序集合的子集，满足其中任意两个元素可比反链偏序集合的子集，满足其中任意两个元素不可比链划分将偏序集合拆分成很多子集称作划分。子集全为链的划分叫做链划分子集全为反链的划分叫反链划分。偏序集合的两个对偶定理定理1令（S,≤）是一个有限偏序集，并令r是其最大链的大小。则S可以被划分成r个但不能再少的反链。定理2（Dilworth定理）

令（S,≤）是一个有限偏序集，并令m是反链的最大的大小。则S可以被划分成m个但不能再少的链。第29页/共46页测序应用转录本拼接算法中涉及到的概念二分图指顶点可以分成两个不相交的集使得在同一个集内的顶点不相邻（没有共同边）的图。设G=(V,E)是一个无向图，如果顶点V可分割为两个互不相交的子集(U,V)，并且图中的每条边（i，j）所关联的两个顶点i和j分别属于这两个不同的顶点集(iinU,jinV)，则称图G为一个二分图。第30页/共46页测序应用转录本拼接算法中涉及到的概念二分图最大匹配给定一个二分图G，在G的一个子图M中，M的边集中的任意两条边都不依附于同一个顶点，则称M是一个匹配.选择这样的边数最大的子集称为图的最大匹配（maximalmatching)最小点覆盖给定一个二分图G，在G的一个子图N中，N的点集中的点与所有的边都有关联（把所有的边都覆盖），则称N是一个点覆盖选择这样的点数最小的子集称为图的最小点覆盖（minimumvertexcover)第31页/共46页测序应用转录本拼接算法中涉及到的概念二分图最大匹配最小点覆盖König定理：最大匹配数等于最小点覆盖数第32页/共46页测序应用转录本拼接DefinitionTranscriptprimarytranscriptgenomiclocationTranscriptometranscriptionlociThegenomiclocationofatranscriptt∈g∈Gdoesnotoverlapthegenomiclocationofanytranscriptuwhereu∈h∈Gandh≠g.Transcriptionlocusisnotbiological.第33页/共46页测序应用转录本拼接Cufflinksisdesignedtoaimforthefollowing:(1)Everyfragmentisconsistentwithatleastoneassembledtranscript.(2)Everytranscriptistiledbyreads.(3)Thenumberoftranscriptsisthesmallestrequiredtosatisfyrequirement(1).第34页/共46页测序应用转录本拼接Apartialorderonfragmentalignmentsx1andy1arecompatiblex2andy2areincompatibley3isnestedinx3x4isuncertain,becausey4andy5areincompatiblewitheachother.第35页/共46页测序应用转录本拼接AssemblingaparsimonioussetoftranscriptsAssembleasetoftranscriptsFindaminimumpartitionPintochainsFindamaximumantichainFindamaximummatchinginbipartitegraphFindaminimumvertexcoverKönig'stheoremDilworththeoremHopcroft-Karpalgorithm第36页/共46页测序应用转录本表达量的表示方法RPKM(ReadsPerKilobaseoftranscriptperMillionmappedreads)实例：假设一个物种的基因组上只有两个基因，基因G1的外显子长8Kb，基因G2的