人工合成细胞Science-2010年

创建由化学合成的基因组控制的细菌细胞摘要：我们报道了根据基因组测序结果来设计、合成并装配一个1.08MMb的支原体MycoplasmamycoidesJCV1syn1.0的基因组，然后把这个基因组移植进入一个支原体M.capricolum受体细胞中，产生了一个仅由合成的基因组控制的新的Mycoplasmamycoides细胞。在这个细胞中唯一的DNA就是我们设计合成的DNA序列，上面包括“水印序列”（Watermark）和其他一些设计进去的基因缺失和多态性以及在基因组构建过程中带进去的突变。这个新的细胞已经呈现出我们预期的表型，而且能够进行连续的复制（增殖）。1977年，Sanger和同事测定了噬菌体X174的完整的遗传序列【1】，这是第一个被完全测序的DNA基因组。18年后，也就是在1995年，我们团队解读了第一个完整的自我复制的细菌流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）的遗传序列【2】。在这些最初的研究的基础上，对多物种的基因组序列进行解读已经成指数般快速发展起来。在过去的25年中，快速对基因组测序的能力已经增长了逾8个数量级【3】。随着对所有这些新的基因组信息的理解和探究，催生了大量新的计算机模拟以及实验研究方面的范例（指著名的研究成果），但是我们对基因组的了解仍然是十分有限。就生物学功能而言，还没有任何一个细胞系统中的基因能够被我们全部理解。即便是在一个单细胞细菌中，它的染色体就包含了遗传需要的所有信息吗？如果这样，一个完整的遗传系统能够通过化学合成的方法根据计算机中测定好的DNA序列信息来起始合成吗？我们对大DNA分子和染色体的合成的兴趣萌生于我们在过去的15年中努力去构建一个仅含有必须基因的最小细胞。这项工作在1995年就已经开展，当时我们测序了生殖支原体Mycoplasmgenitalium的基因组。M.genitalium是一种目前已知的能够在实验室独立生长的拥有最小基因组的细菌。当我们一次失活一个基因进行研究，发现在该M.genitalium的485个编码蛋白质的基因中有超过100个基因都是非必须的【4-6】。我们发展了一种通过把病毒粒子大小的片段组装成大分子DNA的策略，这样使我们能够在4个阶段把化学合成的平均6kb大小的一些DNA区段（cassette）组装成人工合成的M.genitalium基因组。这是通过体外酶学以及酵母菌体内重组相结合的方法来完成的。这个完全人工合成的基因组（含582970碱基对）作为一个酵母着丝粒质粒（YCp）可以稳定地在酵母细胞中生长【7】。在移植一个化学合成基因组进入受体细胞并进行表达的过程中遇到的一些难题已经被我们克服了。我们现在需要改进从酵母体内提取完整的基因组的方法，同时需要掌握如何把这些基因组转入受体菌细胞来构建一个完全由合成基因组控制的细胞。基于M.genitalium生长速率过慢，我们想到了两种快速生长的支原体，即M.mycoides的亚种capri（GM12）作为供体（提供基因组信息），而M.capricolum的亚种capricolum（CK）作为受体（去除自身基因组后，接收合成的基因组）。为从酵母体内移植出合成基因组创造条件和流程，我们发展出把作为酵母菌着丝粒质粒的整个细菌染色体进行克隆的方法，包括克隆了M.mycoides天然的基因组【8,9】。然而，起先将M.mycoides的基因组从酵母中提取出来进而移植入M.capricolum的尝试失败了。我们发现供体和受体支原体利用相同一套限制系统。供体细胞基因组在天然的M.mycoides细胞中被甲基化，所以在从这个供体细胞中提取基因组并进行移植入受体的过程中，移植的基因组因甲基化保护免遭受体细胞限制性酶系的破环【10】。但是，生长于酵母中的细菌基因组没有被甲基化，因此在遭遇受体细胞中的限制系统的限制时不会受到保护。我们就用纯化的甲基化酶或M.mycoides提取物亦或M.capricolum提取物使供体DNA基因组先甲基化，或者干脆破坏掉受体细胞的限制系统以克服这一限制系障【8】。我们现在已经把原先建立起来的程序进行了组合，在这里报道我们通过合成、组装、克隆一个1.08-Mb的基因组（命名为M.mycoidesJCVI-syn1.0基因组）并进行成功移植，从而创造了一个由合成基因组所控制的新细胞。1合成基因组的设计M.MycoidesJCVI-syn1.0基因组的设计是在M.mycoides亚种capriGM12【8，9，11】的两种试验用菌株基因组序列被高度精确测定的基础上进行的：一个是被Lartigueetal.运用的供体基因组（GenBank序列号：CP001621）【10】；另一个是在酵母中克隆和经遗传改造过的基因组YCpMmyc1.1-DtypeIIIres（GenBank序列号：CP001668）【8】通过移植后创造的菌株【8】。我们这项工程的关键依赖于这些序列的精确程度。尽管我们相信这两套已经测序完成的M.mycoides基因组序列都很可靠，但它们之间在95个位点仍存在差别。在两套基因组序列测序完成之前，我们就开始了设计合成基因组的工程。所以，设计合成的大部分DNA区段（cassette）的序列是来自于CP001621的序列【11】。当这两套基因组序列的测序工作完成后，我们就选择了从酵母中成功移植出的基因组序列（序列号CP001668）作为我们的设计参考（我们保留的typeIIIres完整基因是例外）。所有存在于CP001668序列和之前我们合成的DNA区段之间的显著生物学差异被一一修正，使两者精确地匹配【11】。在我们合成的DNA区段序列和CP001668序列之间仍有19处位点序列差异，但因对生物是无害的，所以没有被修正。因而这样在我们合成的基因组（JCVI-syn1.0）和克隆自酵母的天然基因组（YCpMmyc1.1，作为基因组移植标准或对照）序列之间就存在19个序列多态性差异【8】。为了进一步区别合成基因组和天然基因组，我们设计了4种水印序列，用它们去替换一个或多个DNA区段中被预测的（水印序列3<1109bp>和水印序列4<1222bp>）或已经试验证明的（水印序列1<1246>和水印序列2<1081bp>）位置，但这些位置不会影响到细胞的生存。这些水印序列可编码成特定的识别标签，而不会被翻译成多肽。表格S1列出了合成基因组和天然基因组之间的区别。图S2展示了一张M.mycoides的JCVI-syn1.0基因组图。DNA区段和组装片段中间体的边界、水印序列、缺失、插入，以及M.mycoides中JCVI-syn1.0基因组的基因在图S2中都标示出来，而移植得到的支原体克隆sMmYCp235-1的序列已经被提交至GenBank（序列号CP002027）。2合成基因组的组装策略我们设计的起始的DNA片段一般大小为1080bp，与相邻的DNA片段有80bp的重叠序列【11】。这些DNA片段是由BlueHeron公司（Bothell，Washington）通过把化学合成的寡核苷酸进行组装形成的，每个DNA片段是单独合成并由厂商经过测序校对过的。为了有助于后面的构建过程，这些DNA片段和装配中间体的末端被设计成含有NotI限制性酶切位点，在载体存在情况下，在酵母中可以发生重组，并进行生长和筛选7,11】。我们设计了一个分级策略，来分三步，从1.07kbDNA片段开始，通过转化及在酵母中同源重组，把整个基因组组装起来【12,13】。Elementsfor修剥propagationAsciandgenometransplantation—BssHIIWM4AsciBssHII800,0001,077,947OligonucleotideSynthesizerOligonucleotides1,060bpcassettes(1,078)(AssemblBlDSX)TDElementsfor修剥propagationAsciandgenometransplantation—BssHIIWM4AsciBssHII800,0001,077,947OligonucleotideSynthesizerOligonucleotides1,060bpcassettes(1,078)(AssemblBlDSX)TDSOBObpassemblies(109)(AssemblB11X)1D0?000bpassemblies(11)(Assemble1X)BssHIIWM3BssHliBssHIIODE-rQ?-BssHII合成合成基因组的组装。M.mycoides合成基因组是由1078个重叠DNA区段（cassette）经过3步组装而成。第一步，每10个由重叠的合成的寡核苷酸生成的1080-bp区段（橘黄色箭头）重组在一起，共生成109个约10-kb的组装序列（assemble蓝色箭头）；每10个这样10-kb的组装序列重组在一起，共生产11个100-kb的组装序列（绿色箭头）；在组装的最后阶段，这11个组装序列进一步重组生成完整的基因组（红色环）。除了两个片段结构（27）（白色箭头）是在体外通过酶促反应重组外，其他的组装序列都是通过体内同源重组在酵母中完成。在这个合成基因组中区别于天然基因组的绝大多数突变区域用黄色圈表示。这些突变区域包括4个水印区域（WM1~WM4），一个被有意切除的4-kb区域（94D），以及促进酵母生长及基因组移植的有关因子的区域。另外，在20个位点上存在核苷酸多态性（如星形所示）。基因组上的坐标是相对于天然M.mycoides基因组中序列上第一个核苷酸，设计的序列共是1，077,947bp。AscI和BssHII的限制酶切位点如图所示。DNA片段1号和800-810号都不重要，所以从组装策略中去掉【11】。DNA片段2号和区段1104号重叠，DNA片段799号和区段811号存在重叠。2.110kb人工合成中间序列的组装第一阶段，DNA区段cassette和载体在酵母菌中重组，然后被转移到大肠杆菌。质粒DNA随后从大肠杆菌单个克隆中分离出，这些质粒DNA被酶切来检测含有载体上携带有10-kb长的组装片段assemble的细胞。成功重组的10-kb组装片段如图2A所示。总体上，每检测10个酵母菌细胞后至少有一个细胞含有10-kb组装片段，然而成功率在10%-100%间变化。所有的第一阶段中间组装片段都被测序，111个组装片段有19个含有错误。又筛选了一些克隆，经测序验证无误后，进入下一个组装阶段【11】。2.2人工合成的100kb中间组装片段的组装以上这些制备好的10-kb组装片段和它们各自的载体按照上面的方法转化入酵母中以生产100-kb人工合成中间组装片段。我们的试验结果表明这些产物在大肠杆菌体内不能够稳定的存在，因此重组的DNA不得不从酵母中提取。我们用复式PCR来对选择的酵母菌克隆进行筛选（图S3和表格S2）。因为在这个PCR分析中，每个10-kb中间组装片段都对应一对引物，那么如果所有扩增子（用每对引物进行PCR得到的扩增产物）都存在就可以代表一个100-kb中间组装片段已经产生。总体上，25%甚至更多的被检测的酵母菌克隆都能扩增出所有的扩增子（预期是一个完整装配片段扩增所需要的扩增子）。这些克隆中有一个被选出进行进一步筛选。环状的质粒DNA被提取后和超螺旋标记物一起进行琼脂糖凝胶电泳检测大小。第二阶段中，一个成功的装配片段加上载体长度在105kb（如图2B）左右。当所有的扩增子经过复式PCR生成后，而大小也合适的第二阶段装配片段中间体（中间组

装片段）也就得到了。但在一些情况下，会发生小的序列缺失；在另一些情况下，多个10-kb片段会被组装起来会生成一个比预期更大的第二阶段中间组装片段。有幸的是，这些差别在完整的基因组组装之前可以在琼脂凝胶电泳时被轻易的检测出来。2.3完整基因组的组装在准备组装的最后阶段时，必须分离到微克量的11个第二阶段组装片段（中间组装片段）【11】。据报道【14】，像我们试验中得到的第二阶段组装片段大小的环状质粒可以通过碱裂解法将其从酵母原生质体中分离。为了进一步纯化这11个中间组装片段，我们将其用外切酶处理（去除线性酵母染色体），并通过阴离子交换柱。在全部质粒DNA中取一小部分被NotI消化，并经过倒转电场凝胶电泳（FIGE）分析（图2C）。以上方法可以在400ml的酵母培养基中（约10的11次方个细胞）生产出含有1微克DNA的单个第二阶段组装片段（环形形式，在载体上）。而以上方法并不能完全的去除酵母线性染色体DNA，而酵母的线性染色体DNA的存在在很大程度上会降低下一步酵母转化和DNA组装的效率。为了进一步富集这11个环形中间组装片段，我们把含有200ng样品的单个组装片段富集并且和熔融的琼脂混合。当琼脂凝固的时候，纤维穿过琼脂并“困住”环状DNA【15】，没有被“困住”的线性DNA便可以通过电泳从琼脂块中分离出来，这样达到富集环形DNA分子的目的。这11个环状中间组装序列用NotI消化使得其中的插入片段可以释放出来；随后，将插入片段从琼脂块中提取出来，通过倒转电场凝胶电泳（FIGE）分析（图2D），并转入酵母的原生质体中。在组装的第三和最后阶段，不需要附加载体序列，因为酵母克隆因子已经存在于811-900号组装片段中（可以让重组后的合成基因组稳定在酵母中复制）。为了筛选一个完整的基因组，我们用11对引物进行了复合PCR反应，每对引物扩增的是相邻两个中间装配片段的连接位置（表格S3）。在筛选过的48个菌落中，来自一个克隆（sMmYCp235）中提取的DNA可以扩增生成所有的11个扩增子;在野生型（YCpMmyc1.1）阳性对照组的PCR中，也产生了一套与之难以区分的11个扩增子（图3A）。为了深入证实我们已经完整地组装一个M.mycoides合成基因组，完整的DNA用琼脂块法从酵母分离出来，用两个限制性内切酶进行酶切分析：AscI和BssHII【11】。因为这些限制性内切酶的切割位点存在于4个水印序列中的3个序列中，所以选择这样的酶分别去切合成基因组和天然基因组，产生的酶切片段是不同的（图1和3B）。sMmYCp235克隆产生的限制性酶切片段模式符合我们预期的一个完全组装合成基因组的酶切结果（图3C）。2.4合成基因组的移植在以上电泳试验中用到的琼脂块方法（图3c）在基因组的移植试验中也被用到【11】。来自sMmYCp235酵母克隆体中的完整的M.mycoides合成基因组，如所述【8】，被移植入无限制系统的M.capricolum受体细胞中，在含有四环素和X-gal的SP4培养基中在37摄氏度培养，选择蓝色菌落就可以得到结果。从该酵母sMmYCp235克隆中分离的基因组进行移植，对应每个琼脂块可以产生了5-15个抗四环素的蓝色菌落，这个数目和阳性对照YCpMmyc1.1产生的蓝色抗性菌落数目差不多。在所有的移植试验中，菌落的出现主要依赖于M.capricolum受体细胞和M.mycoides基因组这两者要共同存在。ldkb——Bkb—〜4kb—Skb—,**^-10kbassembly(341-350)Released

vecto「120ldkb——Bkb—〜4kb—Skb—,**^-10kbassembly(341-350)Released

vecto「120kbS<-100kbassembly(501-600)IL.66一M.8^08.-.8-le_cmwoos，l*一LOO一写，LOGML.8_曷一A.S6§508.s-~r8_.DDOLE-Js.朋3LTLCKMQ富D00TL06008,Lg■Mu*ljLinearyeastDNA97kb——」ML4B.5kb—■'|^—11piecespooledExpectedSize(kb)图2.中间组装片段的分析（A）NotI和SbfI双酶切分析从大肠杆菌（E.coli）中纯化的组装片段341-350号。这些限制性酶从10-kb插入片段中释放出载体片段（5.5kb和3.4kb）。插入片段DNA在0.8%的E-凝胶中（Invitrogen公司）与载体DNA分开。M是1-kbMarker（NEB公司）。（B）自酵母菌纯化的501-600号组装片段的分析。105-kb的环型DNA（5-kb载体加上100-kb插入序列）在1%琼脂凝胶和外加电压4.5V/cm条件下电泳3小时将其与线性酵母染色体DNA分开。S指示BAC-TrackerDNA超螺旋Marker（Epicentre公司）。（C）NotI酶切分析纯化自酵母菌的11个100kb组装片段。这些DNA片段在1%的琼脂凝胶上经反转凝胶电泳分析。每个组装序列的插入序列的大小如图示。对指示lambda分子量Marker（NEB）。（D）经过如图（C）中所示通过拓扑捕获和NotI酶切分析的11个组装片段集中富集转化酵母菌，C为用来转化酵母菌的DNA的40分之一的用量。12Q0bp—_900bp-700bp—500bp—12Q0bp—_900bp-700bp—500bp—■11300bp-720kb-631kb-534kb-StrainDiasstFragment^andsizetkb]StrainDiasstFragment^andsizetkb]WTAsciNdsites■A'TBssHII666I5M19「Sv吨35Asci(1)665(2)233[3)160I敦从酵%中分离的合（6）533（7）233（B）152成基因组的分析。（A）含有完全组一7■8-9克隆通过复合PCR（利用可生成11种扩增子的340kb-243kb-146kb-48.5kb—装合成基因组的一套引物，其中每对引物扩增的是11个组装片段彼此连接处的区域）来进行筛选。从酵母克隆sMmYCp235（235）提取的DNA为模板扩增生成了用于完整基因组组装的11个组装片段对应的11个PCR产物。作为比较，从酵母WT，野生型）中提取的天然基因组也被分析。PCR产物在2%的电泳胶（Invitrgen公司）电泳分开。L指示100-bp分子量Marker（NEB）O（B）预期的天然野生型M.mycoides基因组和合成基因组经过AscI和BssHII酶切后的限制性片段的大小。（C）天然（野生型）和合成（235）M.mycoides基因组利用琼脂块法从酵母体内分离。另外，DNA从宿主株（H）中纯化。含DNA的琼脂块被AscI或者BssHII消化后得到的DNA片段则通过CHEE电泳得到分离。，所对应的正确尺寸大小的限制性片段由片段的编号（如图B中）指示。半合成基因组的组装与移植为了帮助测试每个100-kb合成的组装片段的功能，我们构建半合成基因组并进行了移植，通过把天然片段和合成片段混合，每个成功构建的100-kb合成组装片段不需要测序其中间片段就可以得到核实。按照之前所描述的方法，我们在酵母中克隆了100-kb的11个重叠天然组装序列【16】：在11个平行反应中，选择平均长度100-kb的片段（将M.Mycoides天然基因组DNA（YCpMmyc1.1）片段化得到）和为其设计的与100-kb插入序列末端重叠的PCR扩增载体在酵母中进行共转化。PCR扩增载体末端含有40-bp序列与100-kb合成组装片段重叠，可用来克隆100-kb合成组装片段，这样在确保有适当的重叠的条件下促进天然片段与合成片段的重组。构建的半合成基因组中含有2到10个中间组装序列是属于11个100-kb的人工合成的组装序列（表格1）。移植之后产生的可繁殖菌落证明了在每个基因组中的部分合成序列没有发生致死突变，在这些100-kb的中间组装片段中只有含811-900号片段的基因组不能进行繁殖。起初，包含有错误的组装片段（811-820）号的酵母克隆用来生成一个合成基因组，发现不能进行移植，这结果是可以预期的，因为该错误是由于单个碱基缺失导致dnaA中发生移码突变（dnaA是染色体复制中的关键基因）。在这之前我们并没有意识到会存在这个突变。通过构建半合成基因组，我们明确的指出811-900号组装片段才是导致合成移植试验失败的罪魁祸首。因此，我们开始重新组装了一个无误的（811-900）号组装序列，并进一步生成sMmYCp235酵母菌株。在dnaA突变基因组中和sMmYCp235合成基因组中仅仅有一个核苷酸的差别，我们把突变基因组作为我们移植实验的阴性对照实验组。我们利用基因组工程在811-900号组装片段上对dnaA突变进行了修复（17），这样在组装的最后阶段一个修复的811-900号组装片段被用来生成一个含有修复基因组的酵母克隆。这个酵母克隆被命名为sMmYCP142并且可以移植。由11片段组装起来的并可以成功移植的所有基因组如表格1所示。GenomeassemblySyntheticfragmentsNaturalfragmentsReconstitutednaturalgenomeNone1-112/11semisyntheticgenomewithonewatermark5WMr101-4,6-^r113/11semisyntheticgenomewithoutwatermarks1-4,6-3,115r%109/11semisyntheticgenomewithoutwatermarks1-4,6-3r10-115r99/11semisyntheticgenomewiththreewatermarkslr2WM,3WM,4r&7WM,3r10-115r910/11semisyntheticgenomewiththreewatermarkslr2WMr3WM,4r5WM,1岫3r10-11911/11syntheticgenoE%311-8Z0correctionofdnaAlr2WM,3WM,4r5WM,&7WM,3r9-11None11/11syntheticgenomej311-900correctionofdnaAlr2WMr3WM,4r5WM,1岫3r5-11NoneTable1,由这11个片段组装成并成功移植的基因组。组装片段2-100号，1；组装片段101-200，2；组装片段201-300，3；组装片段301-400，4；组装片段401-500，5；组装片段501-600，6；组装片段601-700，7；组装片段701-799，8；组装片段811-900，9；组装片段901-1000，10；组装片段1001-1104，11。WM，指水印序列（watermark）。合成并移植的基因组的性状研究为了快速区分M.capricolum的合成移植细胞和M.mycoides的天然细胞，我们引入了两步分析方法。第一步，设计4对引物，对应与4种水印序列中的每一个水印序列，在一次复合

AqL700bp■三——WM4728kb-500=—枷3631kb_B300bp-PCR能产生4种扩增子（如表格S4），所有的这4种扩增子由sMmYCp235的移植株产生，而不是YCpMmyc1.1（如图4A）。第二步，如上所述（如图3C）基因组用AscI和BssHII酶切，进行电泳分析，得到的限制性酶切片度模式与由M.mycoides合成基因组产生的移植细胞相一致。B300bp-TOC\o"1-5"\h\z一一印M2534kb-—6437kb-X5M340kb-S100bp—243kb-*2・《・7100bp——州1146kb-S3—.叫48.5kb—I。Fig.4.移植细胞的分析（A）含有合成基因组的移植细胞通过复合PCR筛选，利用该PCR所用引物对可以对应扩增生成4个扩增子，每个扩增子内有一个水印标记。我们对源自酵母克隆体sMmYCp235的移植体（syn1.0）和酵母中的天然非合成基因组（WT即野生型）一同进行了分析。含有合成基因组的移植体生成了4种PCR产物，而WT（野生型）基因组没有生成任何产物。PCR产物在2%的E凝胶（Invitrogen）中分离。（B）天然的（WT）基因组和人工合成的M.mycoides基因组用琼脂块法从M.mycoides移植细胞中分离。琼脂快被Asc1或者BssH11消化，基因组片段则通过CHEF电泳分离。如图3B,所对应的正确尺寸大小的酶切限制性片段由片段的数字编号指示。来源于sMmYCp235合成基因组的单个移植细胞被测序，我们命名该移细胞为M.mycoidesJCVI-syn1.0。测得的序列与我们预想的设计几乎吻合，仅在已知的核苷酸多态性、8个新的单核苷酸的多态性、大肠杆菌转座子插入序列以及85-bp重复区（二倍体化）上有差别（表格S1）。转座子插入序列和IS1（一种大肠杆菌体内的转座子）在大小和序列上精确的吻合，似乎是合成基因组过程中在移入大肠杆菌阶段时IS1进入10-kb组装片段中。IS1的两侧是来自于M.mycoides的正向重复序列，这暗示IS1是通过转座子机制插入的。85-kb重复区（二倍体化）是非同源性末端连接的结果，这是在我们之前的10-kb组装阶段的测序中没有被检测到的。这两个插入序列所影响的是不重要的基因区域。目前我们没有发现任何合成基因组的序列能被证明是属于受体细胞M.capricolum，这暗示在移植过程中我们的合成基因组完全取代了M.capricolum的基因组。只含有合成基因组的细胞能进行自我复制且能够呈对数扩增。扫描和透射电子显微镜（EMs）下的M.mycoidesJCVI-syn1.0细胞呈现为细小卵形，由细胞浆包裹的细胞（图5，图C,图F）。蛋白质组学分析：同时对M.mycoidesJCVI-syn1.0基因组和野生对照组进行双向电泳分析，两者都显示相同的蛋白质点分布模式，这与之前报告的关于受体M.capricolum【10】的蛋白质点分布有所不同（图S4）。M.mycoidesJCVI-syn1.0基因组中的14个基因被切除或受影响，然而，在琼脂糖平板上培养出现的菌落百分率和菌落形态与含天然基因组MmcyYCp1.1YCp1.1的M.mycoides很相似（比较图5，图A，图B）。在颜色变化单元分析中我们确实观察到了二者生长率上的轻微差别，JCVI-syn1.0移植株细胞比M.capricolumMmcyYCp1.1对照株生长稍微快些（图S6）。cFig.5M.mycoidesJCVI-syn1.0和WTM.mycoides的图片。为了比较JCVI-syn1.0和non-YCpWT株的表型，我们通过将细胞涂布在含有x-gal的sp4琼脂板上培养，观察菌落的形态。在培养三天后，JCVI-syn1.0的菌落因为其细胞中含有lacZ基因可以合成P-galactosidase（&-半乳糖苷酶）而表现蓝色，这种酶可以将X-gal转化为蓝色化合物。（A）野生型细胞不含有lacZ基因而保持白色。（B）两种细胞类型均有为大多数支原体所特有的煎鸡蛋似的菌落形态。我们使用两种方法对,JCVI-synL。分离物进行了电子显微观察。（C）为了电子显微观察，样品被四氧化锇预先固定，脱水并用二氧化碳临界点干燥，最后在2千电子伏的条件下用HitachiSU6600扫瞄式电子显微镜下观察。（D）用1%的醋酸铀在纯碳源培养基上对分裂细胞进行透射电子显微镜观察前负染，在80千电子伏条件下用JEOL1200EX透射电子显微镜观察。为了检查细胞的形态，我们比较了用醋酸铀染色后的M.mycoidesJCVI-syn1.0细胞的电子显微图像（E）及用电子显微镜观察在2006年培养的曾用钼酸铵染色的野生型细胞（F）。两种细胞都显现同样的卵形形态和一般外形。电子显微镜（EM）是由圣地亚哥加里福利亚大学国家显微成像研究中心的T.Deerinck和M.Ellisman提供。讨论在1995年，基因测序的质量水平大概是10000bp中出现一个错误，而测序一个微生物的基因组需要数月。今天，基因测序的精确性大大的提高了。覆盖30到50倍基因组的测序已经常见，而且测序只需要几天的时间。然而，对一个能够移植入受体细胞的没有错误的基因组，且该基因组能够创造一个仅有其控制的新细胞，获得这样一个基因组是很复杂的，同时还需要很多严格控制质量的阶段。我们的成功由于在必需基因dnaA中一个碱基的缺失而被阻扰了数个星期。在含多于100万个碱基对的基因组中的一个必需基因中的一个碱基的错误致使整个基因组失活，而在基因组的非必须基因中所发生的大的基因组的插入和删除并没有观察到任何对生长繁殖的影响。试验证实合成基因组生成的移植细胞具有M.mycoidesde细胞的特性，暗示了一个活体细胞的DNA序列要足够准确，才能根据DNA序列去了解该细胞的合适的功能特点。我们合成的基因组的策略和其他基因组工程策略有明显区别，后者是对自天然基因进行多重插入、代替，删除等修饰【18-22】。这项工作为我们是可以通过电脑设计基因组来生成细胞的这样一个原则（事实）提供证明。细胞基因组的DNA序列的测定允许我们将遗传信息做成数字文件的形式来储存生命细胞。这里提到的合成基因组与天然的M.mycoides基因组仅仅存在有限的修饰上差别。然而，我们的研究所建立的方法应该随着基因组合成设计的发展可以运用到更多新颖的不同细胞基因组的合成与移植中去（23）。我们将这种由化学合成DNA组装成的基因组所控制的细胞称为“合成细胞”，即便受体细胞的细胞质并不是合成的。原来的受体细胞的细胞质带来的表型特征会由于随着蛋白质合成倍增以及随着细胞合成基因组复制而被稀释（消失）。通过在平板上移植和复制后形成一个菌落（＞30代，或者＞稀释倍数10的9次方），后代细胞将不会包含任何原始受体细胞中存在的蛋白质分子【10，24】。这在我们第一次描述基因组的移植时已经阐明【10】。这种由组装基因组控制的细胞的特性应该与一个完全合成的细胞相同（就好比通过DNA软件构建其自身的硬件）。具备生成合成细胞的能力后，使得研究人员在构造合成DNA结构和细胞时有必要对其工作对象进行水印标记，以便将合成DNA及细胞与天然DNA及细胞进行区分。我们在这次的研究和以前的研究都对合成染色体进行了水印标记（7）。如果我们所描述的这种方法能得到了推广利用，那么设计、合成、装配和移植人工合成的染色体在合成生物学的发展进程中将不再是一个障碍。我们希望这种对于DNA合成的花费随着DNA的测序技术发展而并持续成对数下降。低成本合成和自动化的结合将会使人工合成基因组得到广泛应用。我们从工作的初期，就考虑去推动人们进行关于合成生命方面的伦理道德方面的讨论【25,26】。随着合成基因组应用的推广，我们预感这项工作引起的哲学的讨论会更加有社会学和伦理学意义。我们鼓励支持后继的相关话题出现。ReferencesandNotes1F.hn口引etaL,Noturs265,拥7(1977>.2.FlD.Fleischmannetat.fScience269.^96(1995).&J.C.Vent?r,Notun464.(2C1Q).4CA.HutdiisviIIIfta!..Sdence湖.21655,],I.G眼目al.t脸.NafL岫&Sd.U.S.A.103.^25&II.0.5mi讥].I.Glass.C.Allutchi^nIII.].C.Vent&r,inAccessingUncuifivotedMK^o^anisfnsrFromihs期mgmemraOrganismsondGenomesondBock,KZ&ngLer,Ed.(AmericanSocietyforUicrobiDlDgy,V^&hington,DC,2000>?p.3印，D.G.GibsonstaL,Science319.1215(20Ce).C.Lartigueaa!..Sdence325,1693(2009).G.A.Bfndprs日al..Nuciei:Adds既e.3S,255B(201D).1C.C.Lartiguetfat.,Science317,632(2CC7).SupportingmatmLifonSdsnceCnLin*D.G.Gibson,NudekAddsRes.37.69的(2009).D.G.GibsonsinL,ProcNatl.^od.So.U.S.A.105.314促UODB).MFLJ.Devpnifh,匚5.Ntwlon,Gens1&,277(1902).W.Vil.De^n,B.U.Dandi,C.A.7hennasJr.,南就56.^17(1973).5,-11.Leemsta!.,版AcidsRes.31?e29(2003).V.N.Ntskw.7.II.泗巩lr§h即ir。，R,Y.Chuang,版陌eAcids.?«.38.2570(2010).IB.JJ.Ita网K.Isuge,JJ.Koizumi,K.Fujita,由mNat!.H就54(JS.A.1D2.15971(2005).19.MIta构fEBSLstL362.257(1995).2C.II.Mizoguchi.II.Alon.1.Fujic,Sia^d)nal.Appl.国dig46,157(2007).2L].Y.Chun€tfNudeicAcidsRes.35.c4Q(2M7).II.II.岫gttat.,NahinW(2DD9).A.5.Kh^LiL.].J.Collins,NaLRev.GensL11,3fi7(2010).Amy-copl^imacell,withimaisofaboutItT'"g.containsfewerthan10smol就ul旺ofprDt&in.(Ifitcontains20%protein,thisis